澳洲茶樹離體培養器官發生的形態解剖學觀察

肖玉菲，陳博雯，劉雄盛，覃玉鳳，晏 巢，劉海龍*

(1.廣西壯族自治區林業科學研究院、國家林業局 中南速生材繁育實驗室、廣西優良用材林資源培育重點實驗室，廣西 南寧 530002；2.中國林業科學研究院 亞熱帶林業實驗中心，江西 分宜 336600)

澳洲茶樹(Melaleucaahemifolia)為桃金娘科(Myrtaceae)白千層屬(Melateuca)植物，俗稱互葉白千層，其枝葉中含有4-松油醇、桉葉素、α-松油烯等揮發性成分，長期以來作為香料植物在澳洲廣泛種植[1]，其中4-松油醇型澳洲茶樹油的價值最高，是公認的優良天然芳香劑、抗菌劑、防腐劑[2]。20世紀90年代初，由于人們認識到茶樹油的重要商業價值，我國開始引進互葉白千層，陸續在廣東、廣西、福建、海南、云南、貴州等地大面積種植[3]。目前，國際上對茶樹油的需求量極大，價格穩定，而國內市場的需求量也在不斷增長[4]。

澳洲茶樹的繁殖主要有種子繁殖、扦插繁殖和組培繁殖。澳洲茶樹種子小、發芽率低，繁殖較為困難[5]，且基因型復雜，生長變異大，精油含量和成分參差不齊，會大大降低精油的產量[6]；扦插繁殖多受母株和季節限制，繁殖系數較低，大大地限制了其推廣速度[7]；而組培繁殖可以快速獲得大量遺傳性狀一致的優質苗木，滿足大規模栽培生產的需要[8]。

目前，有關澳洲茶樹的研究主要集中在化學成分[9]、扦插繁殖[10]、組培快繁[11]和育苗栽培[12]、專用肥[13]方面，未見其營養器官形態解剖結構方面的報道。本研究從形態學和解剖學角度研究澳洲茶樹組織培養過程中芽分化和根發生的過程，進而揭示其生長特性，旨在為澳洲茶樹組培過程中影響因素的調控與優化提供科學依據，從而對其快速繁殖和生產開發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

澳洲茶樹組培材料來源于廣西林科院資源收集圃；組培繼代芽和根系發育的試驗材料采自廣西壯族自治區林業科學研究院生物技術研究所組培研究室。2017年5月5日開始，選取生長均一、健壯的組培繼代單芽，于同一天接種于繼代培養基(改良MS+6BA 1.5～2.0 mg/L+NAA 0.6～1.0 mg/L+糖30 g/L+瓊脂3.5 g/L)和生根培養基(1/2 B5+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.5 mg/L+糖15 g/L+瓊脂3.5 g/L)上進行誘導培養。分別采集繼代增殖5、10、15、20、25、30 d的組培繼代芽，每次取5株生根培養3、5、7、9、11、13 d的生根組培苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態學觀察 將采集的材料清洗干凈，接種于培養基后置于Motic數碼體式顯微鏡下進行觀察并拍照。

1.2.2 解剖學觀察 將采集的材料用清水沖洗掉培養基，切取要觀察的部位，立即用FAA固定液(75%酒精∶甲醛∶冰醋酸=18∶1∶1)固定48 h以上，置于4 ℃冰箱中保存備用。采用常規石蠟切片法切片[14]，即經酒精系列脫水后，用二甲苯進行透明，在56～58 ℃石蠟中浸蠟，LEICA_EG1150包埋機包埋，LEICA_RM2235切片機切片(切片厚度為8～10 μm)，番紅-固綠雙重對染，中性樹膠封片，LEICA DM2500型數碼生物顯微鏡觀察、記錄并拍照。

2 結果與分析

2.1 澳洲茶樹組培苗莖的解剖結構

觀察其橫切面(圖1)，從外到內分別為表皮(Ep)、皮層(Ct)和維管柱。表皮是近圓形、排列緊密的一層細胞；表皮內層為一層排列不規則的皮層薄壁組織；維管柱包括維管束(Vb)和髓(Pt)，維管束呈束狀不規則輻射排列，被染成紅色，占莖部橫切面的比例較小，厚度約為50 μm；維管束中形成層細胞較小，細胞質濃，染色較深，由排列緊密的分生細胞組成；維管束區域以內為髓部，髓部細胞較大，且排列相對較為整齊。

2.2 澳洲茶樹組培苗根的解剖結構

澳洲茶樹的根由外到內分別由表皮、皮層和維管組織組成(圖2)。表皮(Ep)由1層薄壁細胞組成，排列較為緊密，細胞較小，表皮上無根毛；皮層(Ct)占據根的大部分比例，由8～10層細胞組成，細胞較大，為不規則排列的薄壁細胞，厚度約為180 μm；維管組織由初生木質部(Px)和初生韌皮部(Pp)組成，初生木質部在中心，呈不輻射狀分布，束數不一，根據根的粗細有5～9束不等，初生韌皮部在初生木質部和內皮層之間，呈環狀分布。

圖1 澳洲茶樹組培苗莖的解剖結構

圖2 澳洲茶樹組培苗根的解剖結構

2.3 澳洲茶樹離體培養中芽形成的形態學觀察

澳洲茶樹組培繼代芽增殖時，不形成愈傷組織，直接在葉腋處長出新的腋芽(圖3)。其單芽培養5 d后(圖3-A)，在部分葉腋處開始萌出芽苞(Bd)；培養10～15 d后(圖3-B、圖3-C)，葉腋處芽苞逐漸增多且增大；培養20 d后(圖3-D)，芽苞伸長并逐漸展開，25 d(圖3-E)后腋芽迅速伸長，并長出葉子；培養30 d后(圖3-F)，腋芽生長與原來的單芽無異，并開始逐漸分化形成二級腋芽(Slb)，形成簇狀叢芽。

2.4 澳洲茶樹離體培養中芽形成的解剖學觀察

澳洲茶樹組培繼代單芽在芽誘導培養基上培養5 d后，觀察其橫切面可知(圖4-A)，葉柄處莖表皮細胞開始恢復分生能力并不斷分裂；維管束細胞也有明顯的形態變化，腋芽發生處，維管束細胞層數逐漸增多，厚度達到85 μm，并向外層生長，逐漸突破皮層，形成腋芽生長點(Ap)。培養10～15 d后(圖4-B)，觀察其橫切面，維管束細胞逐漸分裂形成新的維管束，呈放射狀排列，表皮和皮層細胞逐漸分裂包圍新的維管束細胞；觀察其縱切面(圖4-D、圖4-E)，新形成的腋芽生長點逐漸發育、增大，內部逐漸形成維管束，并在其葉柄基部連接的位置與莖的維管束相連接。培養20 d后(圖4-C)，腋芽的解剖結構和主莖完全一樣，包含表皮、皮層、維管束和髓，但每部分結構較主莖細，其中維管束最為明顯，厚度僅為40 μm。培養30 d后，觀察其縱切面發現(圖4-F)，葉原基開始逐漸發育形成葉片，腋芽內多處芽原基再度分裂形成二級腋芽(Slb)，二級腋芽的維管束從一級腋芽的維管束發育分支而來。

圖3 澳洲茶樹芽形成的形態學觀察

圖4 澳洲茶樹芽形成的解剖學觀察

2.5 澳洲茶樹離體培養中根形成的形態學觀察

在離體培養生根過程中，澳洲茶樹組培苗表現出一系列形態變化。培養3 d時(圖5-A)，莖的基部在外觀上尚無明顯變化；培養5 d后(圖5-B)，莖的基部切口處及切口之上開始膨大，形成愈傷組織突起，顏色呈乳白色偏灰色，但無不定根產生；培養7 d后(圖5-C)，有少量根尖突破莖基部膨大組織，形成短粗狀的根；培養9 d后(圖5-D)，約有10條根突破莖基部膨大組織，根短粗，呈乳白色；培養11 d后(圖5-E)，根系數量逐漸增多、伸長，發達根系基本形成，不定根平均長3 cm左右；培養13 d后(圖5-F)，除伸長生長的主根外，在主根側部逐漸長出須根，根最終呈現為灰白色。此外，少量須根會由莖基部切口上端節的部位發出。

圖5 澳洲茶樹根形成的形態學觀察

2.6 澳洲茶樹離體培養中根形成的解剖學觀察

取接種在生根培養基上3 d的莖下部做切片可以觀察到(圖6-A)：維管組織較之前莖中維管組織厚，厚度約為110 μm，維管組織與皮層交界處開始產生與周圍細胞結構明顯不同、染色較深、細胞密度較大的薄壁細胞，并有向外擴張的趨勢。培養5 d后(圖6-B)，維管細胞從形成層位置向外加寬成多列細胞，形成排列緊密的與周圍細胞有明顯區別的圈狀薄壁細胞團，這團薄壁細胞繼續分化逐漸形成根原基(Rp)，隨著根原基的進一步膨大，周圍細胞和維管束被擠壓并推到兩邊。培養7～11 d后(圖6-C～圖6-E)，根原基繼續向外生長，穿過皮層和愈傷組織，伸出表皮，初步形成橫切面近圓形的不定根(AR)。培養13 d后(圖6-F)，在已形成的不定根中再次發現根原基。

觀察其縱切面可見，在根的形成過程中，首先是內皮層的維管細胞大量分裂生長(圖6-G)，形成排列緊密而整齊的薄壁細胞群，細胞質濃，隨后薄壁細胞群不斷生長發育、分化，逐漸突破內皮層后進入皮層薄壁細胞，形成圓柱狀根原基(圖6-H)，在朝向表皮的一端的細胞團轉化為不定根的頂端分生組織，根原基前部細胞繼續分裂，逐漸形成生長點和根冠，生長點細胞繼續分裂、分化，突破其愈傷組織細胞，擠壓皮層細胞，使其破裂形成缺口，根原基內細胞則在一定部位進行旺盛分裂，推動根原基不斷向外伸長，伸出表皮，形成外露的根，根尖后端的細胞不斷生長、分化，逐漸形成維管組織，并與最初莖的維管系統相連(圖6-I)。

3 結論與討論

3.1 芽器官的發生途徑

在植物組織培養中，植物芽器官的發生途徑通常可以分為器官間接發生途徑與器官直接發生途徑2種類型[15]。在器官間接發生途徑中，外植體在培養基中的植物生長物質等因素的誘導下，其細胞經脫分化形成由薄壁細胞所組成的愈傷組織，在適宜的植物生長物質等培養條件下愈傷組織發生生理、生化上的改變，從而使細胞分裂的部位、方向發生改變，再分化出芽、根等器官；器官直接發生途徑是器官發生過程中缺少間接途徑所需的誘導愈傷組織階段，外植體直接分化出器官[16]。有研究報道通過愈傷組織分化形成不定芽的方式獲得再生植株，變異率較高，通過莖尖或分生組織培養增殖側芽可以保持基因型基本不變[17-19]。

圖6 澳洲茶樹根形成的解剖學觀察

在本研究的澳洲茶樹芽器官誘導過程中，不產生愈傷組織，在葉腋處直接發育形成芽，隨著腋芽不斷生長分化，腋芽的葉腋處分化出二級腋芽，最后形成簇狀的叢生芽。澳洲茶樹組培芽器官直接來源于其芽原基的誘導，芽器官再生方式為器官直接發生方式，以這種方式生成器官，可有效地保持其遺傳的穩定性，對于其油分保持優良品質具有重要意義。

3.2 不定根的發生途徑

不定根原基按其形成時間和條件分為潛伏根原基和誘導根原基2種。潛伏根原基是在植株發育早期產生，處于休眠狀態，在適宜環境條件下可繼續發育形成不定根；誘導根原基是經生根處理之后才形成的根原基[20]。澳洲茶樹單芽接種到生根培養基時，莖內并沒有根原基，這種生根方式屬于誘導生根型。

不定根按其形成部位可分為皮部生根型(也稱直接發生)、愈傷組織生根型(也稱間接發生)和混合生根型[21]，愈傷組織生根是芽基部發生愈傷組織，從愈傷組織內分化出根原基，再發育形成不定根；皮部生根是形成層或各部位的薄壁細胞脫分化，轉變為類分生組織，分裂分化產生根原基，再分化發育形成不定根[22]。澳洲茶樹屬于皮部生根型，但研究發現，澳洲茶樹的不定根形成前先形成愈傷組織，從而誘導根原基產生。有研究報道在不定根形成的過程中，若沒有愈傷組織形成，只有莖的初生結構，維管束與形成層交接處形成不了根原基，愈傷組織的存在，對根原基的產生有一定的刺激作用，通常都會先產生愈傷組織，這是因為其可發揮吸收和防御的功能，同時為后期不定根的生長提供營養。但愈傷組織一旦過分發達[23]，就會過多消耗莖內的養分和生根物質，使其老化，也不會有根原基的產生，導致不能生根[24]。本研究發現澳洲茶樹在不定根形成時，若形成的愈傷組織較小，組織培養瓶內產生的根可多達十幾條，而一旦形成較大愈傷，便不能生根，這與上述結論一致。而愈傷組織的大小與激素濃度密切相關[25]，因此，澳洲茶樹進行組培生根時，調節激素的濃度，選擇合適的激素配比，控制愈傷組織的大小，對提高其生根率至關重要。

有研究發現，莖段皮層的構造對不定根的發生有一定影響[26]，如果皮層中存在環狀厚壁組織，則生根則較難，反之，生根則相對容易。澳洲茶樹皮層中并不存在厚壁組織，在合適的培養條件下7 d即可看到粗壯的根，屬于較易生根類型的樹種。

本研究對澳洲茶樹組培苗芽的增殖和不定根發育過程進行了形態學和解剖學觀察，為其器官形成和發育提供了理論依據，為提高澳洲茶樹增殖系數和生根率提供了一定的實踐指導，有利于組培增殖和生根過程中各種問題的解決。