鹽酸環丙沙星乳膏微生物限度檢查方法研究

(德陽市食品藥品安全檢驗檢測中心 四川 德陽 618000)

《中國藥典》要求企業在建立微生物限度檢查法時，應進行方法驗證，以確認所采用的方法是否適合該藥品的微生物限度檢查，以保證供試品所污染的微生物能夠充分檢出。本實驗加入5種污染菌：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌，對各試驗菌的回收率進行逐一驗證，從而建立鹽酸環丙沙星乳膏的微生物限度檢查方法。

一、實驗材料

(一)菌種

大腸埃希菌(CMCC(B)44102)、金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26003)、銅綠假單胞菌(CMCC(B)10104)、枯草芽孢桿菌(CMCC(B)63501)、白色念珠菌(CMCC(B)98003)均購于中國食品藥品檢定研究院。

(二)培養基

胰絡大豆胨瓊脂培養基(151028)、沙氏葡萄糖瓊脂培養基(151019)、胰絡大豆胨液體培養基(1511132)、甘露醇氯化鈉瓊脂(151130)、溴化十六烷基三甲銨瓊脂(151210)均購于北京三藥科技開發公司，培養基已進行適用性檢查，結果符合標準要求。

(三)稀釋液

0.9%無菌氯化鈉溶液、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液

(四)儀器

恒溫培養箱(Binder BD 240)、生化培養箱(揚州慧科 SPX-150)、壓力蒸汽滅菌器(新華醫療 3260J)、電子天平(常州雙杰 JJ200)微生物限度檢測儀(杭州美卓 MZ-302)

(五)樣品

鹽酸環丙沙星乳膏(四川通園制藥有限公司 批號：161007)

二、實驗方法與結果

取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物5ml至胰絡大豆胨液體培養基中，35℃培養24小時，取白色念珠菌的新鮮培養物至5ml沙氏葡萄糖液體培養基中，25℃培養2天，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養物至沙氏葡萄糖瓊脂培養基中，25℃培養5天，加入5ml0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫后，采用滅菌紗布隔離刻度吸管口的方法吸出孢子懸液至無菌試管中，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成黑曲霉孢子懸液，備用。

(一)供試品溶液的制備

稱取供試品10ml，加入到100ml pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，混勻，取制成1:10的供試品溶液，備用。

(二)需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數微生物限度檢查方法驗證

1.試驗組

取上述1:10供試品溶液，加至250ml pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，搖勻，按薄膜過濾法操作，全量過濾后，每張濾膜用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液

分5次沖洗(每次100ml)，在最后一次沖洗液中加入不大于100cfu試驗菌。取濾膜菌面朝上貼于胰絡大豆胨瓊脂培養基或沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上，需氧菌35℃培養3天，霉菌和酵母菌置25℃培養5天。

2.供試品對照組

取制備好的供試品溶液，以稀釋液代替試驗菌液同試驗組操作。

3.菌液對照組

取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試品溶液，按試驗組操作并加入試驗菌液進行微生物回收試驗。

4.中和劑對照組

取相應稀釋液代替供試品，按試驗組操作，已確認中和劑的有效性和對微生物無毒性。

5.需氧菌、霉菌和酵母菌微生物限度方法驗證結果

結果判定：試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值在0.5-2范圍內；中和劑對照組與菌液對照組菌落數的比值應在0.5-2范圍內。

供試品對照和陰性對照試驗結果表

需氧菌總數方法適用性實驗結果

霉菌和酵母菌總數方法適用性實驗結果

中和劑對照組計數結果

上述試驗表明，采用薄膜過濾法時，試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值均在0.5-2范圍內，且中和劑對照組對應5中試驗菌回收比值均在0.5-2范圍內。各試驗菌的回收試驗均符合要求，可采用所用的供試液制備方法及計數方法進行供試品的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數。

(三)控制菌檢查方法驗證

1.金黃色葡萄球菌

(1)試驗組：取1:10供試液10ml，加至200mlpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，按薄膜過濾法操作，濾膜用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液分五次沖洗，每次100ml，最后一次沖洗加入不大于100cfu的金黃色葡萄球菌菌懸液，過濾，取出濾膜至100ml胰絡大豆胨液體培養基中，置35℃培養24小時。取培養物劃線接種甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板，35℃培養48小時，觀察菌落特征。

(2)陰性對照組：以稀釋液代替供試液，同試驗組操作。

(3)結果

胰絡大豆胨液體培養基甘露醇氯化鈉瓊脂培養基試驗組陽性陽性,黃色菌落陰性對照組陰性陰性

經試驗，供試液試驗組平板上有菌落生長，陰性對照組平板無菌落生長，可采用薄膜過濾法處理供試品后進行金黃色葡萄球菌檢查。

2.銅綠假單胞菌

(1)試驗組：取1:10供試液10ml，加至200mlpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，按薄膜過濾法操作，濾膜用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液分五次沖洗，每次100ml，最后一次沖洗加入不大于100cfu胰絡大豆胨液體培養基中，置35℃培養24小時。取培養物劃線接種溴化十六烷基三甲銨培養基平板，35℃培養48小時，若有菌落生長。進行氧化酶試驗。

(2)陰性對照組：以稀釋液代替供試液，同試驗組操作。

(3)結果

胰絡大豆胨液體培養基溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基氧化酶試紙試驗組陽性陽性陽性陰性對照組陰性陰性陰性

經試驗，供試試驗組平板上有菌落生長且氧化酶試驗陽性，陰性對照組平板無菌落生長，可采用薄膜過濾法處理供試品后進行銅綠假單胞菌檢查。

三、討論

該制劑具有較強的抗菌性，起成分具有抑菌作用并影響微生物限度檢查的準確性，因此同其它分析方法一樣，微生物限度檢查也應證明所采用的方法是適宜的，才能保證檢查方法的完整性和準確性。