糖尿病大鼠在不同血糖濃度下傷口愈合情況實驗研究

曾文超，鞏茹，郭洪敏，鞏超，王福寧，趙陽，岳震

(山東省濟寧市第一人民醫(yī)院手足踝外科，山東 濟寧 272000)

糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥已經(jīng)成為一個公共健康問題，因為有較高的致殘率及死亡率，積極預(yù)防、治療糖尿病及其并發(fā)癥成為一個至關(guān)重要的課題。糖尿病足近年來逐漸發(fā)展為糖尿病最重要的并發(fā)癥[1-2]。1/4的糖尿病患者苦于糖尿病足的困擾。糖尿病足部潰瘍處置不當(dāng)導(dǎo)致傷口不愈合，最終發(fā)展為難治性潰瘍，甚至截肢。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報告，到2030年，全球糖尿病的發(fā)病率將從1.71億上升到3.66億[3]。本實驗旨在研究糖尿病大鼠在不同血糖濃度下創(chuàng)面愈合情況，并與正常血糖濃度下傷口愈合情況進行比較，觀察在低水平高血糖時難治性潰瘍的生長愈合情況，為人類的糖尿病治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物準(zhǔn)備 普通3～4個月齡雄性大白鼠(180～220 g)，生活環(huán)境為：溫度(24±1)°，濕度45%～55%，晝夜12 h交替。獨立透明鼠倉生活，食用全價營養(yǎng)顆粒飼料，飲用醫(yī)用過濾水，所有實驗操作均在上午6點至下午6點。飼養(yǎng)小鼠1個月，持續(xù)監(jiān)測血糖，血糖值為(131.4±36.2)mg/dL，雌雄動物間，各飼養(yǎng)單位間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，正常血糖值范圍可估計為60～160 mg/dL。

藥物準(zhǔn)備：鏈唑霉素由美國sigma公司生產(chǎn)，其余普通試劑均為國產(chǎn)。

誘導(dǎo)及評估：單次劑量55 mg/kg鏈唑霉素溶于檸檬酸鹽緩沖液腹腔注射，誘導(dǎo)大白鼠糖尿病模型。10 d后測量大白鼠空腹血糖，血清葡萄糖利用血糖分析儀(美國強生公司)評估。血糖水平不低于250 mg/dL納入樣本范圍，根據(jù)血糖水平高低分為三組，每組10只，分別給予皮下注射胰島素控制血糖，低血糖組(血糖控制在160～190 mg/dL)、中血糖組(血糖控制在190～240 mg/dL)、高血糖組(血糖控制在240 mg/dL以上)。血糖控制平穩(wěn)后繼續(xù)飼養(yǎng)1個月。

動物分組：將誘導(dǎo)成功大白鼠根據(jù)血糖控制水平依次分為四組。I組：糖尿病誘導(dǎo)后給予胰島素控制血糖在160～190 mg/dL；Ⅱ組：糖尿病誘導(dǎo)后給予胰島素控制血糖在190～240 mg/dL；Ⅲ組：糖尿病誘導(dǎo)后給予胰島素控制血糖在240 mg/dL以上；Ⅳ組：糖尿病誘導(dǎo)后給予胰島素控制血糖在160 mg/dL以下。各組均按照模具在相同部位給予相同面積皮膚切除。

1.2 手術(shù)形成創(chuàng)面模型 選擇的大白鼠模型均在局部麻醉下進行手術(shù)處理。麻醉藥物選用5%利多卡因皮下注射，在每只大白鼠背側(cè)去除面積約為1 cm×1 cm全厚皮，形成創(chuàng)面。

1.3 術(shù)后處置 分別于傷后0(傷后當(dāng)天)、3、7、14d處死大鼠，透明方格紙獲取創(chuàng)面形狀，利用Osiris軟件進行創(chuàng)面愈合率測算。

取創(chuàng)面組織標(biāo)本：部分用體積分數(shù)10%甲醛固定后制成石蠟塊保存，其余標(biāo)本一80℃保存待用。將石蠟標(biāo)本制成薄切片，常規(guī)HE染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察創(chuàng)面組織病理學(xué)改變。

2 結(jié) 果

2.1 傷口愈合情況 傷后3d Ⅳ組及Ⅰ組創(chuàng)面愈合率稍高于Ⅱ、Ⅲ組。但在傷后7 d及14 d，Ⅳ組及Ⅰ組創(chuàng)面愈合率明顯高于Ⅱ、Ⅲ組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Ⅰ組傷口愈合率相比Ⅳ組較快，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見表1)。

表1 糖尿病大鼠創(chuàng)傷模型術(shù)后傷口愈合情況

2.2 病理結(jié)果 顯微鏡下Ⅳ組、Ⅰ組與Ⅱ、Ⅲ組相比，皮膚組織結(jié)構(gòu)更加完整，層次清晰，膠原含量較豐富，排列有序，真皮層內(nèi)炎性細胞浸潤少，創(chuàng)面炎性細胞浸潤強烈而局限，壞死組織形成、脫落及時，創(chuàng)面愈合無明顯延遲。巨噬細胞明顯增加。Ⅰ組與Ⅳ組相比，巨噬細胞含量明顯增加。但Ⅰ組與Ⅳ組巨噬細胞含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1)。

a I組，糖尿病誘導(dǎo)+胰島素控制血糖在160～190 mg/dL

b Ⅱ組，糖尿病誘導(dǎo)+胰島素控制血糖在190～240 mg/dL

c Ⅲ組，糖尿病誘導(dǎo)+胰島素控制血糖在240 mg/dL以上

d Ⅳ組，正常血糖范圍

3 討 論

糖尿病所形成的潰瘍是糖尿病后期最常見的并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致截肢的主要原因之一。目前，關(guān)于糖尿病潰瘍經(jīng)久不愈的機制尚不清楚。其愈合過程與其他創(chuàng)面愈合類似，包括：炎癥期、肉芽組織增生期和組織重建期。目前認為糖尿病潰瘍不愈合的主要原因包括：a)局部組織胰島素水平低下導(dǎo)致的創(chuàng)面組織細胞代謝異常；b)創(chuàng)面局部炎癥反應(yīng)失調(diào)；c)晚期糖基化產(chǎn)物在皮膚堆積。

研究表明，炎癥反應(yīng)的失調(diào)是糖尿病引起的潰瘍經(jīng)久不愈的主要原因[4]。在炎癥早期，巨噬細胞在趨化因子的作用下，移行至創(chuàng)面周圍，在內(nèi)皮細胞等釋放的一系列生物活性物質(zhì)的作用下被激活。激活后的巨噬細胞吞噬周圍病原微生物；清除異物、壞死組織；分泌多種細胞因子，促進創(chuàng)面愈合。創(chuàng)面巨噬細胞浸潤數(shù)量和功能與皮膚愈合的關(guān)系已經(jīng)得到廣泛認同。Karkkainen認為[5]高血糖水平導(dǎo)致的傷口巨噬細胞浸潤受阻是傷口延遲愈合或不愈合的重要原因。在創(chuàng)面修復(fù)增生期，巨噬細胞分泌單核細胞趨化蛋白-1、轉(zhuǎn)化生長因子等促進肉芽組織形成，同時巨噬細胞也可以分泌血管內(nèi)皮生長因子，可以促進新生組織中的血管形成。Altavilla等[6]人認為，在皮膚組織中，巨噬細胞是分泌血管內(nèi)皮生長因子C的主要細胞之一。Maruyama等人認為糖尿病小鼠皮膚潰瘍處的巨噬細胞數(shù)量減少，分泌VEGFC的功能降低[7]。魏民在研究中發(fā)現(xiàn)糖尿病足部非缺血性潰瘍難愈合，創(chuàng)面皮膚中巨噬細胞數(shù)量減少，分泌VEGFC的功能降低，其主要原因可能為高糖和/或糖基化終末產(chǎn)物的共同作用[8]。這可能是糖尿病患者創(chuàng)面難愈合的重要原因之一。

在血糖水平較高的情況下，葡萄糖分子與蛋白質(zhì)分子容易發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)，生成AGEs[9]，長時間的高血糖水平導(dǎo)致AGEs沉積于皮膚組織，促使膠原糖基化，形成相互交叉耦聯(lián)的高分子量物質(zhì)，不易被生物酶所降解[10]，從而影響組織重塑，導(dǎo)致血管形成障礙，最終創(chuàng)面難以愈合[11]。另外，糖基化反應(yīng)可影響某些參與創(chuàng)面修復(fù)的功能蛋白質(zhì)分子功能，如糖基化反應(yīng)使表皮生長因子受體失去信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子等生長因子的促細胞增殖功能減弱，不利于創(chuàng)面修復(fù)[12]。另外非酶促糖基化反應(yīng)過程會釋放大量活性氧自由基，導(dǎo)致機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，影響膠原合成，創(chuàng)面愈合延遲[13-14]。

在本項研究中，證實了高血糖環(huán)境下傷口周圍組織的巨噬細胞會出現(xiàn)明顯減少，并且皮膚組織中的AGEs含量明顯增加。兩個因素均對傷口的愈合過程產(chǎn)生了不利影響。從傷口愈合的比例來看，也如以前的研究結(jié)果相同，高血糖的環(huán)境下傷口愈合明顯延遲，個別小鼠在高血糖環(huán)境下傷口不僅沒有縮小，反而擴大。但比較第Ⅰ及Ⅳ組可發(fā)現(xiàn)，大鼠血糖維持在稍高于正常血糖(Ⅰ組)的環(huán)境下，對傷口愈合沒有出現(xiàn)負面影響，反而傷口愈合速度較Ⅳ組快，巨噬細胞及皮膚AGEs無明顯差異，可能有其他因素在低高血糖水平有利于傷口新生血管及肉芽組織的形成，這需要進一步實驗研究。另外，血糖控制在什么范圍會對傷口愈合產(chǎn)生有利環(huán)境，仍需進一步實驗探索。臨床實踐中是否會與實驗結(jié)果相符，也需要進一步臨床認證。

糖尿病大鼠高血糖濃度會嚴重影響創(chuàng)面愈合，并隨著血糖濃度升高影響愈加明顯，但在低水平高血糖濃度下會對傷口愈合產(chǎn)生一定有利環(huán)境，這仍需臨床上的實踐證明。