糖尿病大鼠在不同血糖濃度下傷口愈合情況實驗研究

曾文超，鞏茹，郭洪敏，鞏超，王福寧，趙陽，岳震

(山東省濟寧市第一人民醫院手足踝外科，山東 濟寧 272000)

糖尿病及其相關并發癥已經成為一個公共健康問題，因為有較高的致殘率及死亡率，積極預防、治療糖尿病及其并發癥成為一個至關重要的課題。糖尿病足近年來逐漸發展為糖尿病最重要的并發癥[1-2]。1/4的糖尿病患者苦于糖尿病足的困擾。糖尿病足部潰瘍處置不當導致傷口不愈合，最終發展為難治性潰瘍，甚至截肢。根據世界衛生組織的報告，到2030年，全球糖尿病的發病率將從1.71億上升到3.66億[3]。本實驗旨在研究糖尿病大鼠在不同血糖濃度下創面愈合情況，并與正常血糖濃度下傷口愈合情況進行比較，觀察在低水平高血糖時難治性潰瘍的生長愈合情況，為人類的糖尿病治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物準備 普通3～4個月齡雄性大白鼠(180～220 g)，生活環境為：溫度(24±1)°，濕度45%～55%，晝夜12 h交替。獨立透明鼠倉生活，食用全價營養顆粒飼料，飲用醫用過濾水，所有實驗操作均在上午6點至下午6點。飼養小鼠1個月，持續監測血糖，血糖值為(131.4±36.2)mg/dL，雌雄動物間，各飼養單位間差異無統計學意義，正常血糖值范圍可估計為60～160 mg/dL。

藥物準備：鏈唑霉素由美國sigma公司生產，其余普通試劑均為國產。

誘導及評估：單次劑量55 mg/kg鏈唑霉素溶于檸檬酸鹽緩沖液腹腔注射，誘導大白鼠糖尿病模型。10 d后測量大白鼠空腹血糖，血清葡萄糖利用血糖分析儀(美國強生公司)評估。血糖水平不低于250 mg/dL納入樣本范圍，根據血糖水平高低分為三組，每組10只，分別給予皮下注射胰島素控制血糖，低血糖組(血糖控制在160～190 mg/dL)、中血糖組(血糖控制在190～240 mg/dL)、高血糖組(血糖控制在240 mg/dL以上)。血糖控制平穩后繼續飼養1個月。

動物分組：將誘導成功大白鼠根據血糖控制水平依次分為四組。I組：糖尿病誘導后給予胰島素控制血糖在160～190 mg/dL；Ⅱ組：糖尿病誘導后給予胰島素控制血糖在190～240 mg/dL；Ⅲ組：糖尿病誘導后給予胰島素控制血糖在240 mg/dL以上；Ⅳ組：糖尿病誘導后給予胰島素控制血糖在160 mg/dL以下。各組均按照模具在相同部位給予相同面積皮膚切除。

1.2 手術形成創面模型 選擇的大白鼠模型均在局部麻醉下進行手術處理。麻醉藥物選用5%利多卡因皮下注射，在每只大白鼠背側去除面積約為1 cm×1 cm全厚皮，形成創面。

1.3 術后處置 分別于傷后0(傷后當天)、3、7、14d處死大鼠，透明方格紙獲取創面形狀，利用Osiris軟件進行創面愈合率測算。

取創面組織標本：部分用體積分數10%甲醛固定后制成石蠟塊保存，其余標本一80℃保存待用。將石蠟標本制成薄切片，常規HE染色后，光學顯微鏡下觀察創面組織病理學改變。

2 結 果

2.1 傷口愈合情況 傷后3d Ⅳ組及Ⅰ組創面愈合率稍高于Ⅱ、Ⅲ組。但在傷后7 d及14 d，Ⅳ組及Ⅰ組創面愈合率明顯高于Ⅱ、Ⅲ組，差異有統計學意義(P<0.01)。Ⅰ組傷口愈合率相比Ⅳ組較快，差異有統計學意義(P<0.01，見表1)。

表1 糖尿病大鼠創傷模型術后傷口愈合情況

2.2 病理結果 顯微鏡下Ⅳ組、Ⅰ組與Ⅱ、Ⅲ組相比，皮膚組織結構更加完整，層次清晰，膠原含量較豐富，排列有序，真皮層內炎性細胞浸潤少，創面炎性細胞浸潤強烈而局限，壞死組織形成、脫落及時，創面愈合無明顯延遲。巨噬細胞明顯增加。Ⅰ組與Ⅳ組相比，巨噬細胞含量明顯增加。但Ⅰ組與Ⅳ組巨噬細胞含量差異無統計學意義(見圖1)。

a I組，糖尿病誘導+胰島素控制血糖在160～190 mg/dL

b Ⅱ組，糖尿病誘導+胰島素控制血糖在190～240 mg/dL

c Ⅲ組，糖尿病誘導+胰島素控制血糖在240 mg/dL以上

d Ⅳ組，正常血糖范圍

3 討 論

糖尿病所形成的潰瘍是糖尿病后期最常見的并發癥之一，也是導致截肢的主要原因之一。目前，關于糖尿病潰瘍經久不愈的機制尚不清楚。其愈合過程與其他創面愈合類似，包括：炎癥期、肉芽組織增生期和組織重建期。目前認為糖尿病潰瘍不愈合的主要原因包括：a)局部組織胰島素水平低下導致的創面組織細胞代謝異常；b)創面局部炎癥反應失調；c)晚期糖基化產物在皮膚堆積。

研究表明，炎癥反應的失調是糖尿病引起的潰瘍經久不愈的主要原因[4]。在炎癥早期，巨噬細胞在趨化因子的作用下，移行至創面周圍，在內皮細胞等釋放的一系列生物活性物質的作用下被激活。激活后的巨噬細胞吞噬周圍病原微生物；清除異物、壞死組織；分泌多種細胞因子，促進創面愈合。創面巨噬細胞浸潤數量和功能與皮膚愈合的關系已經得到廣泛認同。Karkkainen認為[5]高血糖水平導致的傷口巨噬細胞浸潤受阻是傷口延遲愈合或不愈合的重要原因。在創面修復增生期，巨噬細胞分泌單核細胞趨化蛋白-1、轉化生長因子等促進肉芽組織形成，同時巨噬細胞也可以分泌血管內皮生長因子，可以促進新生組織中的血管形成。Altavilla等[6]人認為，在皮膚組織中，巨噬細胞是分泌血管內皮生長因子C的主要細胞之一。Maruyama等人認為糖尿病小鼠皮膚潰瘍處的巨噬細胞數量減少，分泌VEGFC的功能降低[7]。魏民在研究中發現糖尿病足部非缺血性潰瘍難愈合，創面皮膚中巨噬細胞數量減少，分泌VEGFC的功能降低，其主要原因可能為高糖和/或糖基化終末產物的共同作用[8]。這可能是糖尿病患者創面難愈合的重要原因之一。

在血糖水平較高的情況下，葡萄糖分子與蛋白質分子容易發生一系列化學反應，生成AGEs[9]，長時間的高血糖水平導致AGEs沉積于皮膚組織，促使膠原糖基化，形成相互交叉耦聯的高分子量物質，不易被生物酶所降解[10]，從而影響組織重塑，導致血管形成障礙，最終創面難以愈合[11]。另外，糖基化反應可影響某些參與創面修復的功能蛋白質分子功能，如糖基化反應使表皮生長因子受體失去信號轉導功能，導致血管內皮生長因子等生長因子的促細胞增殖功能減弱，不利于創面修復[12]。另外非酶促糖基化反應過程會釋放大量活性氧自由基，導致機體處于氧化應激狀態，影響膠原合成，創面愈合延遲[13-14]。

在本項研究中，證實了高血糖環境下傷口周圍組織的巨噬細胞會出現明顯減少，并且皮膚組織中的AGEs含量明顯增加。兩個因素均對傷口的愈合過程產生了不利影響。從傷口愈合的比例來看，也如以前的研究結果相同，高血糖的環境下傷口愈合明顯延遲，個別小鼠在高血糖環境下傷口不僅沒有縮小，反而擴大。但比較第Ⅰ及Ⅳ組可發現，大鼠血糖維持在稍高于正常血糖(Ⅰ組)的環境下，對傷口愈合沒有出現負面影響，反而傷口愈合速度較Ⅳ組快，巨噬細胞及皮膚AGEs無明顯差異，可能有其他因素在低高血糖水平有利于傷口新生血管及肉芽組織的形成，這需要進一步實驗研究。另外，血糖控制在什么范圍會對傷口愈合產生有利環境，仍需進一步實驗探索。臨床實踐中是否會與實驗結果相符，也需要進一步臨床認證。

糖尿病大鼠高血糖濃度會嚴重影響創面愈合，并隨著血糖濃度升高影響愈加明顯，但在低水平高血糖濃度下會對傷口愈合產生一定有利環境，這仍需臨床上的實踐證明。