解淀粉芽孢桿菌L-S60與黃瓜互作特性研究

張 瑩 秦宇軒 尚慶茂 張一凡 李昌輝 李平蘭

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院， 北京 100083； 2.中國農業科學院蔬菜花卉研究所， 北京 100081)

0 引言

植物根際促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是指自由生活在土壤或附生于植物根際的一類促進植物生長及礦質營養吸收和利用，抑制有害微生物的生防益生菌[1]。而PGPR在實際應用過程中，會直接受到附生植物根系分泌物的影響。植物的根系分泌物是調控植物-根際微生物的關鍵因素，是研究PGPR與宿主植物互作影響與機制的關鍵[2]。

根系分泌物作為植物與土壤進行物質交換和信息傳遞的重要載體物質，主要是指植物在生長過程中，通過根分泌的方式向根周圍釋放一些無機離子和有機化合物，這些物質統稱為根系分泌物[3]。研究發現，根系分泌物中含有的諸如糖、氨基酸和有機酸等低分子量物質，對植物-微生物種間互作發揮著重要作用[4]。而對于PGPR來說，這些成分不但可以作為其良好的碳源，還常作為信號分子起到趨化作用，促進其在根際定殖[5]。DE等[6]發現，熒光假單胞菌WCS365受到番茄根系分泌物中的蘋果酸和檸檬酸的趨化作用，并且根系分泌物會影響菌株鞭毛的運動性；PETERS等[7]研究發現，在缺氮條件下，豆科植物的根系通過分泌類黃酮來誘導啟動根瘤菌的結瘤基因nodD的表達，最終導致根瘤菌成功侵染根系并形成根瘤；某些PGPR能夠利用植物根系分泌物的成分作為生物合成的前體，研究表明，燕麥會在根尖部分泌色氨酸用于PGPR轉化為生長素(吲哚乙酸)，進而促進自身的生長[8]。

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)L-S60是一株分離自土壤，具有優良促生抗病特性的植物根際促生菌[9]，應用于植物生防方面具有很大的潛力。為了更好地理解植物根際促生菌與植物互作這一復雜過程，本研究分析淀粉芽孢桿菌L-S60與黃瓜(CucumissativusL.)的互作過程。由于對根際分泌物的趨化和運動性是微生物定殖根際的前提條件，首先研究黃瓜根系分泌物的主要成分有機酸及氨基酸對菌株的的趨化作用及菌株的利用情況。在建立菌株與黃瓜幼苗互作模型后，通過計數的方式研究菌株在水培黃瓜幼苗根系表面的定殖量隨時間變化的關系，并且通過熒光定量PCR的方式分析與黃瓜根系互作后菌株和根際定殖、群集運動、生物被膜形成相關基因轉錄水平的變化。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

解淀粉芽孢桿菌L-S60，由中國農業大學食品科學與營養工程學院應用微生物研究室提供。

黃瓜品種為“中農6號”，由中國農業科學院蔬菜花卉研究所提供。

1.2 菌株受黃瓜根系分泌物成分影響的確定

1.2.1有機酸成分對菌株的趨化試驗

將ADLER[10]的方法略作修改，進行菌株對有機酸趨化作用的定量測定，將不同濃度(50、100、200 μmol/L)的有機酸趨化液(將檸檬酸、草酸、琥珀酸及蘋果酸4種有機酸分別溶于PBS緩沖液，用0.22 μm的濾膜過濾除菌)取5 mL加入6孔細胞培養板中。將活菌數約為108CFU/mL的菌液離心后重懸在等體積的無菌PBS緩沖液中，將吸有菌懸液的內徑1 mm、長度3 cm的無菌毛細管分別放入上述6孔細胞培養板中，37℃靜置1 h，以不加有機酸的PBS緩沖液為空白對照，將6孔細胞培養板中的有機酸趨化液進行平板計數。

1.2.2菌株對有機酸的利用試驗

將活菌數約為108CFU/mL的菌液以0.5%的接種量接種于pH值調節為5.5、濃度200 μmol/L的有機酸(檸檬酸、草酸、琥珀酸、蘋果酸)Hoagland營養液[11]中，以不加有機酸的Hoagland營養液(pH值5.5)為空白對照，37℃、200 r/min培養12、36 h，采用平板計數的方式計算培養液中的菌數。

1.2.3氨基酸成分對菌株的趨化試驗

不同質量濃度(5、10、20 μg/mL)的氨基酸趨化液(將谷氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸及色氨酸4種氨基酸分別溶于PBS緩沖液，用0.22 μm的濾膜過濾除菌)分別取5 mL加入6孔細胞培養板中，其余步驟同1.2.1節。

1.2.4菌株對氨基酸的利用試驗

將活菌數約為108CFU/mL的菌液以0.5%的接種量接種于pH值調節為5.5、質量濃度20 μg/mL的氨基酸(谷氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、色氨酸)Hoagland營養液中，其余步驟同1.2.2節。

1.3 菌株與黃瓜幼苗互作模型的建立

參照GRAHAM等[12]的方法且適當修改，具體方法如下：

(1)種子催芽：取黃瓜種子若干，用清水浸泡2 h，75%乙醇浸泡1 min，5%次氯酸鈉溶液浸泡15 min，無菌水沖洗至無刺鼻氣味。在滅菌的培養皿(內墊有無菌水潤濕的濾紙)中加入適量的無菌水，每皿放置約40粒消毒種子，室溫(20℃)放置1 h后轉至暗處，28℃培養48 h。

(2)將催芽后的種子播種于裝有滅菌無土栽培基質(蛭石與珍珠巖體積比為1∶1)的穴盤中，置于28℃光照培養箱(16 h光照，8 h黑暗)，每隔24 h用2倍稀釋的Hoagland營養液灌根，直至長出第1片真葉(播種后約14 d)。

(3)將穴盤取出，在每孔中加入過量的無菌水，小心拔出黃瓜幼苗，盡量不破壞幼苗的根系，用無菌水洗凈根表面的基質，每20棵黃瓜苗根系浸入添加50 μg/mL利福平的200 mL滅菌水中，2 h后用無菌水洗凈根系。

(4)將活菌數約為108CFU/mL的菌液離心后重懸在等體積的Hoagland營養液中，吸取5 mL加入含有45 mL Hoagland營養液的50 mL錐形瓶中，每瓶加入5棵處理好的黃瓜苗，用無菌脫脂棉封口及固定黃瓜苗。將錐形瓶用錫紙包好(植物根系需避光生長)，在28℃光照培養箱(16 h光照，8 h黑暗)中培養。

1.4 菌株在水培黃瓜幼苗根系表面定殖量測定

按不同培養時間(6、12、18、24、36、48 h)將黃瓜幼苗根系移出，用無菌水沖洗掉根系表面的菌株后，切取1 g根系置于9 mL無菌生理鹽水中，渦旋1 min，平板計數。

1.5 菌株定殖相關基因轉錄水平差異

1.5.1細菌總核糖核酸的提取及反轉錄

按不同培養時間(0.25、0.5、1、2、4、6、8 h)將植物根系移除后，將菌液低溫離心，棄上清液后加入液氮研磨，采用TRIzol法提取細菌總核糖核酸(RNA)[13]。將提取后的RNA進行反轉錄，反應體系為：RNA 5 μg，Random Primer 1 μL，5×RT Reaction Mix 4 μL，TUREscript H-Rtase 0.8 μL，加DEPC水至總反應體系為20 μL。反應條件：25℃，10 min；42℃，30 min；65℃，15 min。

1.5.2實時熒光定量PCR

根據菌株與根際定殖、群集運動、生物被膜形成相關功能的共17個基因設計擴增引物(表1)，采用20 μL反應體系對基因相關轉錄水平進行實時熒光定量PCR檢測，其中SYBR(2×)qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板為1 μL，ddH2O 7 μL。反應條件為：95℃，30 s；95℃，5 s；62℃，30 s；40個循環。數據分析參考MORISSET等[14]的方法。

2 結果與分析

2.1 菌株受黃瓜根系分泌物成分的影響

2.1.1有機酸成分對菌株的趨化試驗

由圖1可知，檸檬酸、草酸、琥珀酸及蘋果酸4種有機酸對解淀粉芽孢桿菌L-S60均具有正趨化作用，整體來看，有機酸對于L-S60的趨化作用都較為微弱，且趨化作用對有機酸的濃度有較強的依賴性。其中，蘋果酸對L-S60的趨化作用最強，以濃度為200 μmol/L時為最佳；而草酸和檸檬酸對菌株的趨化作用相對較弱。

2.1.2菌株對有機酸的利用試驗

由圖2可知，解淀粉芽孢桿菌L-S60能夠利用蘋果酸作為唯一的碳源進行生長，在培養36 h時，活菌數依然保持上升趨勢。而L-S60利用其他3種有機酸的效果并不明顯，雖然活菌數都高于空白對照，但仍為下降趨勢。

表1 與根際定殖、群集運動、生物被膜形成相關基因引物序列Tab.1 Primers sequence of genes involved in root colonization, swarming motility and biofilm formation

圖1 有機酸對L-S60的趨化作用Fig.1 Chemotaxis toward organic acid from L-S60

圖2 L-S60對有機酸的利用Fig.2 Utilization of organic acids by L-S60

2.1.3氨基酸成分對菌株的趨化試驗

圖3 氨基酸對L-S60的趨化作用Fig.3 Chemotaxis toward amino acid from L-S60

由圖3可知，谷氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和色氨酸4種氨基酸對解淀粉芽孢桿菌L-S60均具有正趨化作用，整體來看，氨基酸對于L-S60的趨化作用都較為微弱，且趨化作用對氨基酸的濃度有較強的依賴性。其中，谷氨酸對L-S60的趨化作用最強，而其他3種氨基酸的趨化作用相對較弱。

2.1.4菌株對氨基酸的利用試驗

由圖4可知，解淀粉芽孢桿菌L-S60對于4種氨基酸的利用效果并不明顯，雖然活菌數都高于空白對照，但仍為下降趨勢。其中，L-S60對谷氨酸的利用情況最優，在培養12 h及36 h時，添加谷氨酸的培養液中活菌數顯著大于空白對照及其他種類的氨基酸。

圖4 L-S60對氨基酸的利用Fig.4 Utilization of amino acid by L-S60

2.2 菌株在水培黃瓜幼苗根系表面的定殖量

由圖5可知，L-S60具有在黃瓜幼苗根系表面定殖的能力，且根據定殖菌數隨時間變化的趨勢，在菌株與黃瓜幼苗根際共培養初期，定殖量隨時間的增長而變大，而在共培養18 h時，菌株定殖量達到最大，L-S60的定殖量為1.02×105CFU/g。而共培養18 h后，菌株的定殖量隨時間的增長而逐漸變小。

圖5 菌株在黃瓜根系表面的定殖量Fig.5 Viable count of L-S60 colonizing cucumber root

2.3 菌株定殖相關基因轉錄水平差異

2.3.1表面黏附相關基因轉錄水平差異

L-S60與黃瓜幼苗根系互作不同時間后，sacB、ycdH及yfiQ3個基因的轉錄水平差異見圖6。整體來看，3個與表面黏附相關基因轉錄水平表達上調，尤其是在互作4 h左右，表達顯著上調，因此認為菌株在黃瓜幼苗根系有黏附現象的發生。

圖6 L-S60在不同處理時間sacB、ycdH及yfiQ基因轉錄水平差異Fig.6 Difference of sacB, ycdH and yfiQ gene translational levels of L-S60 at different times

2.3.2表面活性素合成相關基因轉錄水平差異

L-S60與黃瓜幼苗根系互作不同時間后的sfp、yczE、srfAA及comP4個基因的轉錄水平差異見圖7。整體來看，除yczE在處理6 h后表達下調外，其他基因在處理不同時間時整體都表達上調，尤其是在互作0.25～0.5 h左右，4個基因表達顯著上調，因此認為菌株在與黃瓜幼苗根系接觸的過程中會分泌表面活性素。

圖7 L-S60在不同處理時間sfp、yczE、srfAA及comP基因轉錄水平差異Fig.7 Difference of sfp, yczE, srfAA and comP gene translational levels of L-S60 at different times

2.3.3群集運動相關基因轉錄水平差異

L-S60與黃瓜幼苗根系互作不同時間后的efp、swrB及swrA3個基因的轉錄水平差異見圖8。整體來看，3個基因隨著處理時間的增加表達水平由上調逐漸轉變為下調，因此認為菌株與黃瓜幼苗根系接觸初期群集運動能力較強，而后期菌株逐漸黏附在植物根系，形成了生物被膜。

圖8 L-S60在不同處理時間efp、swrB及swrA基因轉錄水平差異Fig.8 Difference of efp, swrB and swrA gene translational levels of L-S60 at different times

2.3.4生物被膜合成相關基因轉錄水平差異

L-S60與黃瓜幼苗根系互作不同時間后的spo0A、sigH、sinR、epsA、yqxM、sipW及tasA7個基因的轉錄水平差異見圖9。整體來看，spo0A、sigH及sinR為生物被膜形成過程中的全局調控因子，spo0A、sigH表達出現先下調后上調的趨勢，而sinR表達出現逐漸下調的趨勢；在處理時間8 h左右，epsA的表達水平上調并不明顯，而yqxM-sipW-tasA操縱子表達均上調，因此認為菌株與黃瓜幼苗根系互作過程中能夠形成生物被膜。

圖9 L-S60在不同處理時間spo0A、sigH、sinR、epsA、yqxM、sipW及tasA基因轉錄水平差異Fig.9 Difference of spo0A, sigH, sinR, epsA, yqxM, sipW and tasA gene translational levels of L-S60 at different times

3 討論

3.1 菌株受黃瓜根系分泌物成分的影響

一般來說，根系分泌物被認為是影響根際微生物行為和分布的重要因素，由于它們中不同的組分會在根系的不同部位呈現不同的濃度分布，進而導致對不同組分有趨化性及偏好性的微生物會呈現出不同的趨化性與定殖行為[15]。RUDRAPPA等[16]發現擬南芥受病原菌侵染后分泌的蘋果酸可以誘導根際促生菌(枯草芽孢桿菌)定殖；LING等[17]研究發現蘋果酸和檸檬酸可以促進多粘類芽孢桿菌SQR-21在西瓜根際的定殖。HEINRICH等[18]研究了小麥根分泌物對其根際細菌Azospirilliumlipoferum的趨化作用，認為根系分泌物中的氨基酸組分是一種正趨化物質；樂毅全等[19]研究發現假單胞菌No.5對鳳眼蓮根系分泌物中的亮氨酸、絲氨酸、纈氨酸具有正趨化性。

KAMILOVA等[20]的研究發現，黃瓜根系分泌物中含量最多的4種有機酸為檸檬酸、草酸、琥珀酸和蘋果酸，因此本試驗研究這4種主要有機酸對菌株的趨化作用及菌株的利用情況。結果顯示，這4種有機酸菌對L-S60均具有正趨化作用，且蘋果酸的趨化作用最強。而菌株對除蘋果酸外其他3種有機酸的利用效果并不明顯，這可能是由于培養液中有機酸濃度較低，營養成分不足以讓菌株生長，只能減緩其死亡的速度。

KIMANI等[21]研究發現，黃瓜根系分泌物中含量最多的3種氨基酸為谷氨酸、苯丙氨酸和半胱氨酸。而色氨酸是植物生長素吲哚乙酸(IAA)的前體，對于植物的生長發育起到重要的作用，因此本試驗研究這4種氨基酸對菌株的趨化作用。結果顯示，4種氨基酸對L-S60均具有正趨化作用，且谷氨酸的趨化作用最強。而菌株對于4種氨基酸的利用效果均并不明顯，雖然活菌數都高于空白對照，但仍為下降趨勢，這可能是由于培養液中氨基酸濃度較低，營養成分不足以讓菌株生長，只能減緩其死亡的速度。

本試驗結果顯示，解淀粉芽孢桿菌L-S60對黃瓜根系分泌的4種有機酸及氨基酸具有正趨化作用，并且能夠分別利用其中部分有機酸和氨基酸，這為菌株能夠在黃瓜幼苗根系定殖提供了有力的理論依據。此外，根系分泌物具體成分在植物-微生物互作方面的詳細機制目前尚未明了，有待進一步研究。

3.2 菌株在黃瓜幼苗根系定殖情況

本試驗采用水培黃瓜幼苗的方式建立了解淀粉芽孢桿菌L-S60與黃瓜根系互作的模型，首先通過計數的方式考察了菌株在黃瓜幼苗根系的定殖情況。雖然在共培養18 h時達到了最大定殖量，但隨著時間的延長，菌株的定殖量降低較大。這可能是由于在模型建立的初始，菌株能夠利用黃瓜根系分泌出的營養物質生存，但由于營養物質有限，水培營養液中又沒有菌株可利用的能源，導致菌株由于環境惡劣的原因轉變成芽孢休眠狀態，進而導致根際定殖量的下降。而劉健等[22]也發現了類似的情況，巨大芽孢桿菌在小麥根際定殖量也會隨著時間的延長而降低。

本試驗通過熒光定量PCR的方式研究了與黃瓜互作菌株定殖相關17個基因轉錄水平的差異，為了方便討論，將這17個基因分為4類：①sacB、ycdH及yfiQ3個基因均與細菌在根系的表面黏附過程相關，sacB表達果聚糖蔗糖酶(胞外)，產物果聚糖與細菌的根系粘附定殖相關[23]；ycdH表達高親和性Zn2+ABC運輸脂蛋白，與細菌在根系的表面粘附過程相關[24]；yfiQ表達細菌的表面粘附蛋白[24]。②sfp、yczE、srfAA及comP4個基因均與表面活性素合成過程相關，sfp表達脂肽和聚酮化合物(主要抗菌物質)合成必須的磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶[25-26]；yczE表達影響脂肽和聚酮化合物合成的跨膜蛋白[25-26]；srfABCD表達Surfactin(表面活性素)合成酶[25]，其中srfAA為srfABCD基因簇中的關鍵基因；comP表達ComX傳感器激酶，調控Surfactin的合成[26]。③efp、swrB及swrA3個基因均與表面活性素合成過程相關，efp表達延伸因子P(Elongation factor P)類似蛋白，為細菌群集運動所必需的蛋白[27]；swrA和swrB表達群集運動所必需的蛋白(Swarming protein)[27]。④spo0A、sigH、sinR、epsA、yqxM、sipW及tasA7個基因均與生物被膜的合成過程相關，spo0A表達產孢的全局調控因子，在生物被膜形成的初始階段起著重要的作用[28]；sigH表達RNA聚合酶相關的調控因子σH因子(Sigma factor H)，在芽孢生成階段調控spo0A啟動轉錄，但不影響生物被膜的起始，對生物被膜中輻射狀結構的生長發揮了重要的作用[28-29]；sinR表達生物被膜形成的全局調控因子，負調控生物被膜的形成[30]；epsA-O表達胞外多糖生物合成操縱子，為合成生物被膜所必需[31]，其中epsA為epsA-O基因簇中的關鍵基因；yqxM-sipW-tasA操縱子表達合成生物被膜基質的主要蛋白，yqxM能夠合成脂蛋白，sipW表達Ⅰ型信號肽酶，tasA表達芽孢外壁形成的相關蛋白[32]。其中，磷酸化的Spo0A會促進下游sinI基因的表達，sinI為sinR的對抗物，sinI會解除sinR對epsA-O和yqxM-sipW-tasA操縱子的抑制作用，進而正向調控生物被膜的形成。此外，表面活性素作為一種自我誘導劑也能夠促進yqxM基因的表達，促進生物被膜的形成。

將L-S60與黃瓜幼苗根系互作不同時間后，4類與菌株定殖相關的基因轉錄水平具有較為顯著的差異變化：①sacB、ycdH及yfiQ3個基因在不同處理時間都表達上調，尤其是在互作4 h左右表達顯著上調，可能是由于菌株在與黃瓜幼苗根系接觸一段時間后，黏附相關的蛋白才會大量表達。②除yczE在處理6 h后表達下調外，sfp、srfAA及comP3個基因在處理不同時間時整體都表達上調，尤其是在互作0.25～0.5 h左右，4個基因表達顯著上調，可能是由于表面活性素在菌株與黃瓜幼苗根系接觸初期發揮作用，因此相關基因的表達水平在接觸初期會呈現顯著的上調。③efp、swrB及swrA3個基因隨著處理時間的增加表達水平由上調逐漸轉變為下調，可能是由于菌株與黃瓜幼苗根系接觸初期其根系分泌物中的信號分子對菌株由趨化作用，菌株的群集運動能力較強，基因表達水平上調；而隨著處理時間的增加，菌株逐漸黏附在植物根系，形成生物被膜，運動能力下降，基因水平表達下調。④spo0A、sigH表達出現先下調后上調的趨勢，而sinR表達出現逐漸下調的趨勢。3個全局調控因子表達水平的不同步可能是由于對照組(0 h)菌株沒有與植物根系接觸，環境相比于同根系共培養的菌株更為惡劣，刺激菌株產孢，因而導致初始對照組的spo0A表達水平上調；而隨著處理時間的增加，菌株逐漸在黃瓜根系黏附，開始形成生物被膜，因此表達水平下調。在處理時間8 h左右，sinR表達下調，epsA-O及yqxM-sipW-tasA這兩個操縱子表達均上調。但epsA的表達水平上調并不明顯，可能是處理時間較短造成的，此時epsA-O中其他基因可能參與了調控。根據這4類基因的轉錄水平差異，從分子的水平上檢測出了菌株在與黃瓜幼苗根系互作的過程中，發生了根際定殖的現象。

本試驗采用水培黃瓜幼苗的方式建立的解淀粉芽孢桿菌L-S60與黃瓜根系互作的模型，雖然具有易于收集菌體、菌株及黃瓜幼苗受其他外界條件干擾小的優點，且從短期培養結果上來看也比較接近菌株的定殖行為，但長期培養時其厭氧的水培環境不利于好氧微生物的生命活動，因此建立更為真實的模擬菌株與植物根系互作模型問題還有待解決。

4 結束語

通過對解淀粉芽孢桿菌L-S60與黃瓜互作過程的研究，確定了菌株能夠部分利用黃瓜根系分泌物的主要成分有機酸(檸檬酸、草酸、琥珀酸和蘋果酸)及氨基酸(谷氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和色氨酸)成分，且受到這些成分的趨化作用，其中對于蘋果酸和谷氨酸的利用情況及受趨化作用最優。在建立了菌株與黃瓜幼苗互作模型后，通過計數的方式研究了菌株在水培黃瓜幼苗根系表面的定殖量隨時間變化的關系，并且通過熒光定量PCR的方式，從與黃瓜根系互作后菌株與根際定殖、群集運動、生物被膜形成相關基因轉錄水平差異上分析，菌株具有在黃瓜幼苗根系表面定殖的能力，且菌株最大定殖量為1.02×105CFU/g。