肝移植受者抗乙肝主動免疫構建與Th17及Treg細胞占比變化的相關性

竇古楓，朱雄偉，陳新國，盧實春，李 威，侯 娜，肖 樺，游 波，宋 軍，牛玉堅,

接種乙肝疫苗是預防乙肝病毒感染最重要的措施[1,2]。對于乙肝相關性肝病而行肝臟移植的患者，誘導其產生抗乙肝主動免疫具有重大臨床意義[3,4]。本課題組的前期研究發現，外周血Th2細胞在CD4+細胞中占比升高與抗乙肝主動免疫構建成功率升高有關[4]。本研究在此基礎上進一步探討了外周血Th17細胞和Treg細胞在淋巴細胞中占比變化與抗乙肝主動免疫構建的關系，為提高構建抗乙肝主動免疫成功率提供理論支撐和臨床經驗。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2015-02至2017-06在我院隨訪診療的肝移植受者144例。其中，男127例，女17例，中位年齡41.4(18～68)歲，術后中位時間為43.4(18～85)個月。納入標準[5]：(1)年齡18～68歲；(2)術前HBsAg陽性；(3)入組時HBsAg陰性；(4)肝移植術后時間累計超過18個月；(5)6個月內反應肝功能指標在正常范圍內，有升高者不超過正常值2倍；(6)入組前10 d之內不存在發熱等提示感染的情況；(7)乙肝免疫球蛋白(hepatitis B immunoglobulin，HBIg)使用劑量為不超過800 U/月，維持血清抗-HBs滴度在60(±10) mU/ml，并能夠持續超過3個月；(8)術后持續服用核苷(酸)類似物[nucleos(t)ide analogues，NAs]。排除標準[5]：(1)對接種乙肝病毒疫苗過敏者；(2)妊娠期或者哺乳期女性；(3)合并其他肝臟相關病毒感染者。所有研究對象均簽署知情同意書，均為心臟死亡供肝肝移植。此研究經醫院倫理委員會審查批準。

1.2 分組 按照預先的編碼隨機分為四組，每組36例。(1)傳統組：入組后當天、第1個月、第6個月各接種疫苗1次，每次肌肉注射20 μg；(2)傳統加強組：入組后當天、第1個月、第6個月各接種疫苗1次，每次肌肉注射60 μg；(3)快速組：入組后當天、第1個月、第2個月、第3個月各接種疫苗1次，每次肌肉注射40 μg；第4個月、第5個月、第6個月各接種疫苗1次，每次20 μg；(4)胸腺肽組：入組后當天、第1個月、第2個月、第3個月各接種疫苗1次，每次肌肉注射40 μg；第4個月、第5個月、第6個月各接種疫苗1次，每次肌肉注射20 μg，本組同時皮下注射胸腺肽6個月， 10 d/次，每次1.6 mg。

1.3 試驗藥品 (1)乙肝疫苗：上海葛蘭素史克生物制品有限公司，20 μg/支；(2)胸腺肽：Patheon Italia S.P.A(意大利蒙沙培森藥廠)，1.6 mg/支。

1.4 NAs與HBIg治療方案[5]NAs按照原有方案一直延續使用至接種前。HBIg延續接種之前方法，若接種疫苗以后，抗體滴度達到了基礎值的兩倍，那么就停止繼續輸注HBIg。

1.5 Th17細胞及Treg細胞占比測定 按照流式細胞儀[6]所講述的方法，采用BriCyte E6流式細胞儀及相關試劑，測定淋巴細胞中Th17細胞及Treg細胞百分比。

1.6 抗乙肝主動免疫構建成功的判定標準[5]研究期間，血清抗-HBs滴度升高至基線水平兩倍或以上而停用HBIg后抗-HBs滴度持續≥60 mU/ml至少3個月。

1.7 隨訪管理 (1)從接種疫苗開始，每個月檢測下列指標：血清抗-HBs滴度、血常規、ALT、AST、免疫抑制劑藥物濃度；(2)在入組前和實驗結束后檢測下列項目：肝功能、腎功能、血清抗-HBs濃度、淋巴細胞亞群、免疫抑制劑藥物濃度、Th17細胞和Treg細胞占比淋巴細胞數值。

2 結 果

144例中，有2例在研究過程退出(1例定居國外，1例自動放棄，均為男性)，有效樣本量為142例。

2.1 抗乙肝主動免疫構建成功率 傳統組、傳統加強組、快速組和胸腺肽組成功率分別為2.78%(1/36)、5.56%(2/36)、22.9%(8/35)和34.3%(12/35)。與傳統組相比，傳統加強組增長差異無統計學意義(χ2=0.348，P=0.555)，而快速組與胸腺肽組增長顯著(χ2值分別為6.464和11.779，P值分別為0.011和0.001)。

2.2 血清抗-HBs滴度變化情況 試驗前血清抗-HBs滴度的基線值在四組間差異無統計學意義(P=0.413)。試驗后與試驗前相比，傳統組有增加但無統計學意義(P=0.079)，其余三組均有顯著增加(P值分別為0.017、0.002和0.000)。與傳統組相比，另外三組增幅均顯著大于傳統組(P值分別為0.032、0.005和0.000，表1)。

2.3 Th17細胞占淋巴細胞百分比的變化情況 試驗前Th17細胞占比在四組間差異無統計學意義(P=0.984)。四組病例試驗后較試驗前Th17占比均顯著降低(P值分別為0.014、0.000、0.000和0.000)。與傳統組相比，另外三組降幅均顯著大于傳統組(P值分別為0.000、0.001和0.000，表1)。

2.4 Treg細胞占淋巴細胞百分比的變化情況 試驗前血清Treg細胞占比在四組間差異無統計學意義(P=0.451)。試驗后與試驗前相比，傳統加強組稍有升高而另外三組稍有下降，但變化均無統計學意義(表1)。

表1 四組肝移植受者試驗前后抗-HBs滴度、Th17占淋巴細胞百分比及Treg占淋巴細胞百分比變化情況

注：與傳統組比較，①P<0.05

2.5 抗-HBs滴度增幅與Th17降幅相關分析 將本組142例有效病例試驗前后血清抗-HBs滴度增幅與外周血Th17細胞占比降幅進行相關性分析，結果顯示二者呈顯著正相關(r=0.276，P=0.002，表2)。

表2 四組肝移植受者試驗前后抗-HBs增幅與Th17降幅相關性

2.6 安全性指標分析 血常規、肝功能、腎功能、血糖、血脂、免疫抑制藥血藥濃度和淋巴細胞亞群等檢測指標在實驗前后變化無統計學差異，觀察期間未出現排斥反應。

3 討 論

乙肝相關性肝病肝移植受者接種乙肝疫苗意義重大[7]，在沒有使用NAs或HBIg的情況下，乙肝復發率接近100%，乙肝復發將嚴重影響肝移植預后[8]，故乙肝相關性肝病曾被視為肝移植禁忌證。將NAs和HBIg應用于臨床后，肝移植后乙肝復發得到了有效的控制，文獻[9]稱5年復發率可以降低到在5%以下。NAs和HBIg的聯合使用在患者身心健康、經濟壓力、不良反應等方面存在很多弊端[4,9-11]，需要不斷探索創新有效的預防方法。本課題組在前期工作的研究中，采用了不同的免疫接種方法，使疫苗的構建成功率從傳統接種方法的2%左右逐步提高到了33.3%[4,5]。本次研究結果顯示成功率達34.3%，進一步驗證了課題組接種方法的穩定性。這在一定程度上解決了臨床難題，但成功率尚不能滿足臨床需求，需要進一步深入研究，以使成功率進一步提高。

Th17細胞為CD4+輔助性T細胞[12]，是一類促炎性反應細胞亞群，通過分泌致炎因子IL-17參與自身免疫疾病與感染的調控[13,14]。炎性反應是宿主對感染的一種有益反應，但反應過度會導致炎性疾病，也會抑制免疫功能[15]。有研究發現乙肝疫苗不應答與Th17細胞積累有關，即Th17細胞的增多抑制了抗體的生成[16]。筆者的研究結果顯示，Th17細胞降幅與抗-HBs滴度增幅呈顯著正相關，這不僅從反面印證了上述報道，還提示了Th17細胞占比的降低弱化了對免疫系統的抑制從而促進了抗體生成。Treg細胞屬于抑制性T細胞，通過分泌IL-10發揮較強的免疫抑制效應，弱化機體特異性免疫，并在維持免疫耐受方面發揮重要作用，能使抗原的刺激無法激活T、B細胞而產生免疫應答[17-19]。本研究試驗后與試驗前相比，全部四組受試者中有三組血清抗-HBs滴度有顯著增加，而四組的Treg細胞占比均無顯著性變化，提示抗-HBs變化與Treg細胞占比無相關性，這與文獻報道不同，可能與樣本量不足或免疫抑制藥的使用在一定程度上影響了Treg細胞的變化有關。Th17細胞與Treg細胞具有相互刺激作用， Chen等[20]研究表明，Treg細胞能夠促進Th17細胞的體內、外分化并增強其功能，而Th17細胞是刺激和支持體內Treg細胞增殖和表型穩定的最有力因素。

對于乙肝相關性肝病肝移植受者，構建抗乙肝主動免疫具有重要意義。目前的研究盡管使構建成功率得到大幅度提升，但仍不能滿足臨床需求，需進一步深入研究以使成功率進一步提高。由于Th17細胞對疫苗接種成功率存在調節的作用，若在接種疫苗之前利用相應的措施去降低體內Th17細胞比例，那么對主動免疫的構建將起到積極的促進作用，這為今后研究方向提供了一個創新思路。