髓樣細胞觸發受體-1基因rs9471535單核苷酸多態性與男性早發冠心病的相關性

楊 勇，孟濤疆，馬東星，劉 英，沈志奇，黃 潔，趙 清，王冉冉，楊長春

近年來，冠心病(coronary artery disease, CAD)的發病率和死亡率在我國持續上升，其中男性CAD患者比例明顯高于女性，且均呈現發病年輕化趨勢[1]。目前，臨床上根據CAD發病流行病學調查結果將男性CAD發病年齡≤55歲稱為早發冠心病(premature coronary artery disease, PCAD)[2]。相較于女性PCAD患者發病仍受月經周期期間體內激素水平變化影響，男性PCAD的發病過程中遺傳因素發揮著重要作用，而關于遺傳機制方面的研究報道相對較少。研究發現，冠心病的主要病理基礎是動脈粥樣硬化，是一種進展性動脈壁增厚的慢性炎性反應過程[3]。而髓樣細胞觸發受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)在一系列研究中顯現出其對炎性反應及氧化應激反應的調控效力[4-7]。2014年，Golovkin等[8]以俄羅斯人群為研究對象探討了TREM-1基因以rs9471535為代表的若干SNP位點與CAD發病的相關性，結果顯示其與CAD發病顯著相關。但是目前國內尚無這方面報道。本研究旨在探討TREM-1基因rs9471535位點與男性PCAD發病的相關性。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇原武警總醫院心內科2015-08至2017-01收治的男性住院患者(年齡≤55歲)，經冠狀動脈造影確診CAD的患者納入PCAD組，選擇冠狀動脈造影或冠狀動脈CTA排除CAD的健康對照者納入對照組。CAD的診斷標準為：冠狀動脈造影顯示3支主要冠狀動脈(左前降支、左回旋支及右冠狀動脈)中至少有1支狹窄程度≥50%并符合2008年美國心臟協會頒布的冠心病診斷標準。

1.1.1 納入標準 (1)年齡18～55歲；(2)北方地區(出生、成長并久居于北方地區)漢族人群，且相互間無血緣關系；(3)符合冠狀動脈造影或冠狀動脈CTA檢查指征并完成冠狀動脈造影或冠狀動脈CTA檢查；(4)患者知情同意，自愿參加。

1.1.2 排除標準 (1)嚴重肝、腎功能異?；蚰δ墚惓Ｕ?；(2)圍術期有明顯消化道出血，30 d內有活動性出血病史或對抗凝藥物存在過敏體質及明顯禁忌；(3)對造影劑過敏者；(4)入院血常規檢查血小板計數<100×109/L或>300×109/L，白細胞計數<4×109/L或>10×109/L；(5)患腫瘤性疾病且預期壽命小于3個月者。收集患者的一般情況及冠心病相關的臨床資料，包括年齡、冠心病史、糖尿病史、高脂血癥病史、吸煙史。

1.2 實驗步驟

1.2.1 DNA提取 本研究提取基因組DNA采用上海捷瑞生物工程有限公司提供的血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)。

1.2.2 DNA引物 TREM-1基因rs9471535[C/T]位點信息如下：TTTTAAATTTAAATAAAAAGATTCC[C/T]ACTGCTAAATAAACAAAAAAATAAC；上下游引物見表1；擴增片段長度為244 bp，GC堿基比例為31.97%。

表1 rs9471535單核苷酸多態性位點引物序列

注：TREM-1：triggering receptor expressed on myeloid cells-1

1.2.3 PCR反應體系及反應條件 反應體系的組成成分如下：基因組DNA，1 μl；10×buffer，1.5 μl；MgCl2(25 mM)，1.5 μl；DNTP(10 mM)，0.3 μl；引物(10 p)，0.15 μl；Taq酶(5 U/μl)，0.3 μl；H2O，補至15 μl。PCR擴增條件：預變性94 ℃，3 min，變性94 ℃，30 s，退火55 ℃，30 s，延伸72 ℃，90 s，變性、退火、延伸35 cycles，再次延伸72 ℃，3 min。

1.2.4 連接酶檢測反應(ligase detection reaction, LDR) LDR反應體系如下：PCR產物，3 μl；10×Taq DNA ligase buffer，1 μl；Taq DNA ligase(40 U/μl)，0.125 μl；探針(10 p)，0.01 μl；H2O，補至10 μl。LDR連接條件：94 ℃反應30 s；56 ℃，3 min，共30個循環。取1 μl的連接反應產物，加入8 μl的加樣緩沖液HiDi(高度去離子甲酰胺)以及2 μl的Marker，混勻后在95 ℃下變性3 min，立即冰水浴，然后加樣到ABI 3730XL測序儀中進行毛細管電泳。最后通過判讀電泳結果對目的SNP位點進行分型。

2 結 果

2.1 一般資料比較 研究最終收集男性PCAD患者121例，平均(47.47±5.47)歲；對照組196例，平均(45.77±6.35)歲。PCAD組高血壓病史、糖尿病、高脂血癥及吸煙患者比例均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。

表2 PCAD組與對照組人口統計學及臨床資料比較 (n;%)

2.2 基因分型毛細管電泳峰圖 圖1為ABI 3730XL測序儀中毛細管電泳基因分型檢測結果：A為TT基因型，B為CC基因型，C為CT基因型。

圖1 rs9471535位點毛細管電泳圖

2.3 TREM-1基因rs9471535多態性分析 研究人群中TREM-1基因rs9471535位點基因型的分布符合 Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律。統計分析發現，基因型(CC/CT/TT)組間分布有統計學差異(P=0.017)，等位基因組間比較無統計學差異(P=0.720，表3)；單因素分析表明，與TT基因型相比，rs9471535位點CC基因型在PCAD組與對照組間的分布無統計學差異；多因素分析結果顯示，rs9471535位點CC基因型在PCAD組與對照組間的分布有統計學差異(P=0.011，表4)。

表3 兩組PCAD患者rs9471535(C/T)SNP基因型和等位基因頻率 (n; %)

表4 TREM-1基因rs9471535多態性與PCAD相關性Logistic回歸分析

3 討 論

髓樣細胞觸發受體(triggering receptor expressed on myeloid cells, TREM) 是一類表達于免疫系統髓樣細胞的免疫球蛋白超家族。在這一免疫球蛋白超家族中，目前研究較多的成員包括TREM-1、TREM-2、TLT-1及TLT-2等。其中，TREM-1是最早于2000年被發現并報道的受體蛋白[9]。而編碼人的TREM-1基因位于6p21.1，長度約為19 kb，由6個外顯子和5個內含子組成。研究表明，TREM-1通過調節白細胞介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)[10,11]和NF-κB[12-14]等炎性因子活性，進而觸發和擴大炎性反應中各種炎性因子級聯效應，在固有免疫和適應性免疫中起著重要的調節作用，可能參與了動脈粥樣硬化的病理過程[15]。

本研究發現，rs9471535位點在研究人群中分布符合 Hardy-Weinberg 平衡定律，提示本研究所選擇的樣本具有較好的人群代表性。初步統計分析發現，兩組間三種基因型(CC/CT/TT)分布明顯不同，差異有統計學意義，提示TREM-1基因rs9471535位點可能與PCAD發生相關。經Logistic回歸，進一步校正兩組間冠心病的一些傳統危險因素(高血壓、糖尿病、高脂血癥及吸煙)后，結果仍然顯示該SNP位點CC基因型相較于TT基因型而言，對PCAD發生起保護性作用，也就是說，攜帶CC基因型的男性患者出現PCAD的風險相較于TT或TC基因型更低。繼我課題研究組呂強等[16]2017年完成相關TREM-1基因與冠心病發病相關研究后，國內陸嬌等[17]于2018年亦進行了TREM-1基因與冠心病發病的群體遺傳學報道。該報道提示rs9471535位點可能與冠心病發病相關，特別是與急性冠脈綜合征(ACS)密切相關。兩研究在疾病發病的群體遺傳學趨勢上是一致的。上述研究結果與國外Golovkin 等[8]報道的結果相近，即rs9471535與冠心病發生相關。但是，國外研究認為，攜帶CC基因型人群發生冠心病的風險可能會增高。研究人群種族各異、基因分型方法不同，以及與所選研究人群主要集中在中國北方地區等，可能是造成上述研究結果間差異的主要原因。

綜上所述，本研究于國內率先就rs9471535位點與男性PCAD發生的相關關系進行了比較，發現CC基因型在研究人群中分布有統計學差異，攜帶CC基因型的人群發生PCAD的風險相對較低。另外，本研究為橫斷面研究，僅入選研究期間的男性PCAD患者，且研究對象相對較少、樣本量有限，選取的研究人群主要為中國北方地區，因而其結果不能完全代表中國大陸漢族人群PCAD的全部特點，結果的外延性受到限制。上述局限性也促使有必要進行更大規模的流行病學調查分析，從而為男性PCAD的發病機制提供理論依據。

(致謝：感謝中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所提供的技術及專業指導)