間充質(zhì)干細(xì)胞治療椎間盤退行性變的研究進(jìn)展

李浪平，楊 娟，熊源長，曲文春*

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院麻醉科，上海 200020

2.美國梅奧醫(yī)學(xué)中心物理和康復(fù)醫(yī)學(xué)科，明尼蘇達(dá)州 55905

3.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院麻醉科，上海 200433

椎間盤退行性變（IDD）是引起下腰痛的主要病因之一［1］，IDD導(dǎo)致的椎間隙狹窄是下腰痛重要發(fā)病機(jī)制［2-3］。成人椎間盤是人體最大的無血管組織且細(xì)胞含量較少［4］。IDD不同于正常衰老，衰老屬于生理現(xiàn)象，不引起疼痛，而IDD則會引起髓核細(xì)胞（NPC）活性下降、數(shù)量減少，椎間隙高度丟失等，從而產(chǎn)生下腰痛。IDD的非手術(shù)治療［5］和手術(shù)治療［6］對短期疼痛緩解有一定的效果，但疼痛復(fù)發(fā)率較高，手術(shù)治療甚至?xí)涌焱还?jié)段或相鄰節(jié)段椎間盤的退行性變，且均不能從根本上中止或者逆轉(zhuǎn)IDD的發(fā)病進(jìn)程。因此，探索從分子生物學(xué)方面阻止甚至逆轉(zhuǎn)IDD的發(fā)展進(jìn)程具有重要的臨床意義。近年來，干細(xì)胞治療技術(shù)的飛速發(fā)展為從根本上治療IDD帶來希望，本文對應(yīng)用廣泛的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）治療IDD的相關(guān)研究進(jìn)行分析，現(xiàn)綜述如下。

1 治療IDD的干細(xì)胞來源及分化

與所有干細(xì)胞治療技術(shù)一樣，干細(xì)胞選擇至關(guān)重要。由于NPC和軟骨細(xì)胞無論在表型上還是在分子標(biāo)記物上都很相似，因此，能夠分化為軟骨細(xì)胞的干細(xì)胞就是潛在的治療IDD的干細(xì)胞來源，目前主要有MSCs。將MSCs誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞的技術(shù)和條件已經(jīng)較為成熟［7-8］。合適的干細(xì)胞來源主要特征：①細(xì)胞豐富；②易于獲取；③有誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞的能力；④能夠在低氧及低血糖的環(huán)境下增殖且盡量少甚至沒有免疫反應(yīng)，且同時不會誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長。動物實驗中，MSCs移植可取得與NPC移植相似的結(jié)果，MSCs能成功誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞［9-10］，目前常用于IDD治療的干細(xì)胞以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（AMSCs）為主，另外還有NPC、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UC-MSCs）及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）等。

BMSCs具有很強(qiáng)的自我增殖、多向分化潛能和免疫耐受等特點，而且取材方便，便于得到足夠數(shù)量的細(xì)胞。BMSCs在特定條件下具有向髓核樣軟骨細(xì)胞分化的潛能，并且能表達(dá)與NPC所分泌的細(xì)胞外基質(zhì)相似的Ⅱ型膠原蛋白、蛋白多糖等優(yōu)點。2003年，Sakai等［11］首次將BMSCs用于IDD治療研究，將自體BMSCs聯(lián)合載體去端肽膠原移植到兔IDD模型中；結(jié)果提示，BMSCs移植能減緩?fù)米甸g盤的退行性變，該結(jié)果為治療人類IDD帶來了希望。Kim等［12］建立了新西蘭白兔MSCs和NPC的共培養(yǎng)體系，以將MSCs誘導(dǎo)分化為髓核樣細(xì)胞。在沒有機(jī)械刺激的情況下分組研究MSCs與NPC的最佳比例和機(jī)械刺激效應(yīng)：第1組（MSCs）、第2組（NPC），第3、4、5組（NPC與MSCs的比值分別為1∶1、1∶2和2∶1），培養(yǎng)10 d。結(jié)果顯示，第5組髓核樣細(xì)胞增殖較多，MSCs分化程度明顯增加；對第1，2和5組增加機(jī)械刺激后，可促進(jìn)MSCs向髓核樣細(xì)胞的分化，證實了機(jī)械刺激對分化的貢獻(xiàn)。但骨髓抽取為有創(chuàng)過程，且抽取量也受到一定限制。

AMSCs與BMSCs具有較為相似的生物學(xué)特性，它們在生長動力學(xué)、細(xì)胞老化、基因轉(zhuǎn)染和細(xì)胞的黏附特性等方面沒有明顯差異。AMSCs相較于BMSCs的優(yōu)勢在于來源更廣，容易分離和采集，可隨時在皮下脂肪組織中提取，容易獲得大量有分化潛能的干細(xì)胞，相關(guān)研究亦證明了對IDD具有改善作用［13-14］，但誘導(dǎo)分化為軟骨樣細(xì)胞的能力還需進(jìn)一步證實。

UC-MSCs為多能干細(xì)胞，無倫理障礙；對于IDD患者，不可能自體取得。

iPSCs來源于體細(xì)胞，通過誘導(dǎo)異位重組轉(zhuǎn)錄因子（OCT3/4、SOX1/2/3、c/N/L-MYC、KLF2/4、NANOG、和LIN28）的表達(dá)而生成，來源于髓核組織的iPSCs可以誘導(dǎo)分化為髓核樣軟骨細(xì)胞，自我更新、增殖、分化能力強(qiáng)；有腫瘤產(chǎn)生的可能。

誘導(dǎo)MSCs向軟骨樣細(xì)胞分化有多種方法。體外實驗顯示，在特定的培養(yǎng)基中，如低氧以及富含多種誘導(dǎo)刺激因子，如轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1、TGF-β3、胰島素樣生長因子（IGF）-1、IGF-2、生長分化因子（GDF）-5和骨形態(tài)蛋白（BMP）等，MSCs通過與NPC直接接觸后，誘導(dǎo)分化為髓核樣細(xì)胞［15］。另外，基因治療已經(jīng)用于加強(qiáng)MSCs向軟骨樣細(xì)胞分化的過程，如編碼軟骨細(xì)胞分化過程中轉(zhuǎn)錄抑制因子SOX-9的SOX-9基因［16］、細(xì)胞凋亡抑制劑；原型致癌基因Bcl-2等也用來加快MSCs向軟骨樣細(xì)胞分化的過程［17］。

2 MSCs 在治療IDD中的應(yīng)用

2.1 動物實驗

研究表明，BMSCs和AMSCs都能分化成髓核樣表型細(xì)胞，繼而產(chǎn)生蛋白多糖和Ⅱ型膠原蛋白修復(fù)發(fā)生退行性變的椎間盤［18-19］。Peroglio等［18］認(rèn)為，載體HA-pNIPAM的添加能更有效誘導(dǎo)人BMSCs向椎間盤表型分化，培養(yǎng)的細(xì)胞中Ⅱ型膠原，SOX-9，細(xì)胞角蛋白-19，分化簇24和叉頭蛋白F1表達(dá)量更高。MSCs植入發(fā)生退行性變的椎間盤后，一方面能增殖分化為髓核樣細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)合成新的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），增加受累椎間盤的高度和含水量；另一方面，活化的MSCs能分泌多種細(xì)胞因子、生長因子，促進(jìn)椎間盤細(xì)胞的生長以及ECM的合成，并起到營養(yǎng)、抗炎以及免疫調(diào)節(jié)作用，從而改善內(nèi)環(huán)境，緩解臨床癥狀。多項動物實驗通過采用不同的評價指標(biāo)與安慰劑組相比較均證實了MSCs治療IDD的療效。Freeman等［20］在羊模型中對比研究了3組發(fā)生退行性變的椎間盤環(huán)形缺損修復(fù)效果；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較對照組，MSCs治療組在造模術(shù)后3 ～ 6個月有明顯修復(fù)。在兔IDD模型中，交聯(lián)透明質(zhì)酸（XHA）支架負(fù)荷MSCs可以促進(jìn)椎間盤再生［21］。從解剖學(xué)角度評價，MSCs組的椎間盤高度和椎間盤高度指數(shù)明顯增加［13，22-23］；從組織學(xué)角度評價，MSCs組NPC及含水量增加，MRI T2WI信號增強(qiáng)代表椎間盤含水量增加［13，23-24］。盡管各研究間數(shù)據(jù)存在不同程度差異，但總體結(jié)果仍顯示MSCs移植能減慢、中止甚至逆轉(zhuǎn)椎間盤的退行性變過程［25］。Jin等［26］利用TGF-β3與AMSCs聯(lián)合培養(yǎng)，產(chǎn)生比單純AMSCs更加明顯的椎間盤樣細(xì)胞和ECM表達(dá)產(chǎn)物。在兔IDD模型中SOX-9基因轉(zhuǎn)錄入BMSCs后可以明顯提高其對發(fā)生退行性變的椎間盤的修復(fù)。除了基因干預(yù)外，某些物理方法，如軸向牽引也可促進(jìn)兔發(fā)生退行性變的椎間盤再生，其機(jī)制在于軸向牽引可以增加局部的水分和營養(yǎng)［27］。

一項系統(tǒng)綜述納入了24項動物實驗研究，對862個椎間盤進(jìn)行了MSCs注射治療；結(jié)果顯示，所有來源的MSCs都成功地抑制了IDD的發(fā)展，在大部分動物模型中椎間盤高度都明顯提高，其中BMSCs的抑制作用最明顯［28］。Wang等［29］報道的一項關(guān)于干細(xì)胞治療IDD的Meta分析，共納入22個動物實驗研究項目（包含9項隨機(jī)對照試驗），其中17項研究選擇的干細(xì)胞為BMSCs，5項為AMSCs；結(jié)果顯示，MSCs治療組椎間盤高度指數(shù)升高、MRI T2WI信號強(qiáng)度增強(qiáng)、Ⅱ型膠原蛋白mRNA表達(dá)增加、組織學(xué)水平的IDD級別下降；認(rèn)為干細(xì)胞移植能有效緩解或阻止四足動物的IDD過程。從大量動物實驗結(jié)果看，MSCs對IDD具有一定治療效果，但后續(xù)需要更多的大樣本隨機(jī)對照研究以進(jìn)一步評判療效。

2.2 臨床試驗

Kumar等［30］進(jìn)行了為期12個月的單組Ⅰ期臨床試驗，共入選10例疼痛持續(xù)＞ 3個月、疼痛視覺模擬量表（VAS）評分＞4分、Oswestry功能障礙指數(shù)（ODI）≥30%的下腰痛患者，分別向低劑量（2×107個細(xì)胞，n=5）組和高劑量（4×107個細(xì)胞，n=5）組患者椎間盤內(nèi)注射透明質(zhì)酸（HA）載體聯(lián)合AMSC。隨訪1年結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低劑量組和高劑量組各3例患者VAS評分、ODI和生活質(zhì)量量表（SF-36）評分顯著改善，2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。6例有顯著改善的患者中，3例MRI顯示椎間盤含水量增加。

Noriega等［31］報道的隨機(jī)對照研究中，將24例經(jīng)非手術(shù)治療無效的IDD慢性腰痛患者隨機(jī)分為2組。試驗組在局麻下向椎間盤內(nèi)注射同種異體BMSCs，對照組采用椎旁肌肉組織的假性浸潤。隨訪1年結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)BMSCs治療的患者疼痛及生活質(zhì)量明顯改善，MRI檢查示椎間盤明顯改善。Mochida等［32］的研究納入9例20 ～ 29歲患者，IDD Pfirrmann分級3級，在行融合術(shù)時取出NPC和自體BMSCs共培養(yǎng)1周后再用1×106激活的NPC重新移植入融合節(jié)段鄰近椎間盤；隨訪3年，JOA評分從術(shù)前（14.2±4.8）分改善至（27.2±1.6）分；MRI未見移植的椎間盤有不良現(xiàn)象；所有病例均無下腰痛；說明以上治療可延緩IDD進(jìn)程。Pettine等［33］的一項開放性臨床試驗共入選26例患者，采用自體BMSCs治療IDD，隨訪12個月，患者疼痛明顯減輕、椎間盤脫水程度改善且無明顯不良反應(yīng)。Orozco等［34］共納入下腰痛患者10例，采用自體BMSCs治療，隨訪1年發(fā)現(xiàn)患者VAS評分和ODI均明顯改善（有效率為71%），在治療3個月時改善最為明顯（有效率為85%），椎間盤含水量明顯增加，療效與脊柱融合術(shù)或椎間盤置換術(shù)相當(dāng)。

總結(jié)以上5項關(guān)于干細(xì)胞治療IDD安全性及有效性的臨床試驗，通過評估其安全性和耐受性、VAS評分或數(shù)字評分法（NRS）、ODI及MRI，結(jié)果顯示，臨床試驗結(jié)果中均無明顯并發(fā)癥發(fā)生、治療組的疼痛明顯減輕、功能明顯改善、MRI顯示治療后椎間盤含水量明顯增加。

近年，關(guān)于UC-MSCs在IDD中的應(yīng)用潛力也受到越來越多的關(guān)注，體內(nèi)和體外試驗均證明了這一類干細(xì)胞的增殖分化能力，并發(fā)現(xiàn)其移植到人體椎間盤后能有效緩解疼痛［35］。目前MSCs治療IDD還處于亞臨床試驗階段，大部分研究的病例數(shù)還很少，干細(xì)胞來源主要是自體MSCs。也許隨著技術(shù)的成熟，將會有更多的臨床試驗研究逐漸開展。

3 MSCs用于治療IDD的機(jī)制及潛在風(fēng)險

IDD與促炎性細(xì)胞因子（如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α）大量釋放有關(guān)。而MSCs之所以能有效改善IDD與其能調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)有關(guān)。MSCs通過分泌保護(hù)因子，如細(xì)胞因子和趨化因子，起到抗炎及免疫調(diào)節(jié)的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在體外用IL-1β刺激時，NPC由炎性介導(dǎo)的退行性變指數(shù)明顯增加，而當(dāng)NPC和BMSCs一起共培養(yǎng)時，NPC的退行性變和凋亡指數(shù)明顯下降，而且IL-1β刺激的NPC會明顯吸引和介導(dǎo)BMSCs的遷移。這說明在IDD中BMSCs可以發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)，并且可以被炎性反應(yīng)刺激后的NPC介導(dǎo)向病變部位遷移［36］。一項隨機(jī)對照的兔IDD模型研究也認(rèn)為，MSCs可以延緩椎間盤高度指數(shù)下降的原因是MSCs可以抑制凋亡［23］。Cao等［37］發(fā)現(xiàn)當(dāng)BMSCs與NPC共培養(yǎng)時可以明顯延緩NPC的基質(zhì)發(fā)生退行性變，其機(jī)制是上調(diào)TGF-β同時抑制NF-κB信號通路的表達(dá)。MSCs植入后微環(huán)境發(fā)生變化，移植部位NPC之間的相互作用機(jī)制決定了MSCs的轉(zhuǎn)歸。最近的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體是BMSCs和NPC之間傳遞生物信息的重要載體，外泌體自身或通過攜帶基因或藥物可能可以有效用于治療IDD［38］。

干細(xì)胞治療IDD有一定的作用，但也有潛在風(fēng)險［25］：①細(xì)胞泄漏引起椎管內(nèi)骨贅形成，繼而造成椎管狹窄。②干細(xì)胞移植涉及的椎間盤面積更大，可能發(fā)生感染的概率增高。③干細(xì)胞的多能性誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。為了減少細(xì)胞泄漏的發(fā)生，可使用細(xì)胞載體，如去端膠原肽凝膠、水凝膠、透明質(zhì)酸凝膠等，膠原微球支架可以明顯減少注射后骨贅形成［39］。合適的載體除了可以防止細(xì)胞滲漏到椎管，還可以給細(xì)胞提供一個有效的增殖分化環(huán)境，因此，加強(qiáng)細(xì)胞載體的研究很有必要。為防止椎間盤感染或椎間盤炎的發(fā)生，嚴(yán)格管理細(xì)胞培養(yǎng)、無菌手術(shù)操作至關(guān)重要。另外，建議患者術(shù)前常規(guī)使用抗生素。盡管MSCs是否會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生目前還存在爭議，但是這種潛在的可能性需要被重視。因目前還沒有辦法做到免疫監(jiān)測，如果MSCs需要較長的增殖期，染色體穩(wěn)定性勢必會降低，腫瘤的發(fā)生概率就可能增加。研究發(fā)現(xiàn)，使用患者的血清或者血小板裂解液來縮短細(xì)胞培養(yǎng)時間，可以降低染色體不穩(wěn)定的風(fēng)險。

4 結(jié)語和展望

IDD會引起椎間盤高度降低、NPC含量減少。動物研究表明，MSCs通過增殖分化為軟骨細(xì)胞后，能有效修復(fù)發(fā)生退行性變的椎間盤；增殖分化后的軟骨樣細(xì)胞能合成蛋白多糖和Ⅱ型膠原蛋白形成ECM，它們同時還能調(diào)整椎間盤的內(nèi)環(huán)境。由于BMSCs及AMSCs安全、免疫耐受，是目前研究和治療IDD的最佳干細(xì)胞。但MSCs治療IDD仍然存在一些風(fēng)險，細(xì)胞載體的選擇、移植技術(shù)的改進(jìn)及無菌操作技術(shù)等能一定程度降低風(fēng)險。從現(xiàn)有的研究來看，MSCs用于臨床治療IDD具有可行性，有望逆轉(zhuǎn)IDD的病程，但需要更多的基礎(chǔ)與臨床研究來評估其安全性和有效性。干細(xì)胞移植后如何適應(yīng)新的微環(huán)境并繼續(xù)增殖分化為NPC是未來需要解決的問題，有待進(jìn)一步研究探索。