急性脊髓損傷患者血清蛋白質組學研究

高 瑞，楊成偉，王偉恒，周許輝

海軍軍醫大學附屬長征醫院骨科，上海 200003

急性脊髓損傷（SCI）是脊柱外科的常見疾病之一［1］。目前尚缺乏有效、特異性的實驗室檢查手段或評估指標。SCI后的病理過程可分為原發性損傷和繼發性損傷，原發性損傷是指椎體或椎間盤等對脊髓造成的直接壓迫，繼發性損傷是指在原發性損傷后脊髓出現出血和炎性反應［2］。目前脊髓繼發性損傷的病理生理機制和生物化學通路尚未完全明確［3］。近年來，蛋白質組學技術已經廣泛應用于各種疾病的標志物檢測研究，本研究采用非標記相對定量蛋白質組學（labelfree）技術比較急性頸部SCI患者和健康人群血清蛋白質譜，對差異表達的蛋白進行生物信息學分析，以期發現急性SCI后的重要差異表達蛋白。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2013年7月—2014年12月，收集9例急性頸部SCI患者（傷后24 h內）作為病例組，收集9例性別、年齡與病例組相匹配的健康體檢者作為對照組。病例組均為男性，年齡32 ～ 55歲，平均47歲，記錄患者損傷時間，并進行頸椎日本骨科學會（JOA）評分［4］。對照組也均為男性，年齡31 ～ 54歲，平均44歲。2組患者均無惡性腫瘤、自身免疫病及慢性傳染病等疾病。

1.2 儀器及主要試劑

酶聯斑點分析儀（CTL公司，美國）；Q-Exactive液相色譜-質譜聯用系統（Thermo公司，美國）；EASY-nLC1000納升級流速高效液相色譜系統（Thermo公司，美國）；去除人14種高豐度蛋白的多重親和排除系統（Aligent公司，美國）；胰蛋白酶（Promega公司，美國）。

1.3 血液樣本收集和血清蛋白處理

患者傷后送入急診時即用肝素抗凝采血管收集其空腹靜脈血液，4℃離心（1 500 r/min，離心半徑19.5 cm，10 min）。每3份血清樣本隨機合并，作為一個生物學重復，每組3個重復。取血清樣品，去除血清中高豐度蛋白，將低豐度蛋白超濾濃縮。濃縮后加入適量裂解液，沸水浴15 min，定量后，-80℃保存。每份樣品取200 μg，加入二硫蘇糖醇（DTT）至濃度為100 mmol/L，4℃離心（8 000 r/min，離心半徑19.5 cm，10 min），離心2次后加入0.5%胰蛋白酶40 μL，37℃孵育18 h。

1.4 液相色譜-串聯質譜分析

按定量結果取3 μg酶解產物進行液相色譜-串聯質譜分析，采用EASY-nLC1000納升級流速高效液相色譜系統進行分離。經液相分離后用Q-Exactive液相色譜-質譜聯用系統進行質譜分析。分析時長為120 min，檢測方式為正離子，母離子（m/z）掃描范圍為300 ～ 1 800。

1.5 非標記分析和生物信息學分析

將液相色譜-串聯質譜原始文件導入Maxquant 1.3.0.5軟件進行非標記定量分析，數據庫為ipi.human.3.68.fasta。所得的查庫文件使用Perseus 1.3.0.4軟件進行分析。獲得的差異表達蛋白在基因本體論（GO）數據庫進行注釋分析，包括細胞組分、分子功能和生物學過程分析。在京都基因與基因組百科全書（KEGG）軟件進行通路分析。采用Cytoscape 3.2.1軟件的BiNGO 3.0.3插件進行富集分析。

1.6 統計學處理

使用SPSS 16.0軟件對數據進行統計學分析。組間各血清蛋白質平均豐度的差異比較采用獨立樣本t檢驗，以檢驗結果P ＜ 0.05或差異倍數＞ 2的蛋白被認為是差異表達蛋白。采用Spearman相關分析探討差異表達蛋白與年齡、損傷時間以及JOA評分的相關性。

2 結 果

2.1 基本信息

病例組9例患者損傷時間為3 ～ 24（16.4±3.1）h，頸椎JOA評分為6 ～ 13（9.2±1.7）分。

2.2 差異表達蛋白

共發現483個蛋白，其中22個蛋白呈現差異表達。與對照組相比，病例組中有11個蛋白表達上調，包括果糖-二磷酸醛縮酶、碳酸酐酶等；11個蛋白表達下調，包括免疫球蛋白等（表1）。

2.3 差異表達蛋白與損傷時間及JOA評分的關系

Spearman相關分析結果顯示，11個表達上調蛋白與損傷時間和頸椎JOA評分呈正相關；11個表達下調蛋白與損傷時間和頸椎JOA評分呈負相關（表1）；22個差異表達蛋白均與損傷時年齡無關。

2.4 生物信息學分析

GO和BiNGO分析結果顯示，22種差異表達蛋白主要參與碳酸鹽轉運、碳酸酐酶活性、B細胞受體信號通路及細胞活化過程（表2），主要富集于大分子復合物、細胞外區、細胞膜、細胞器及膜封閉腔（表3）。將所有的差異表達蛋白進行KEGG通路分析，共發現了4個有統計學意義的代謝通路：果糖和甘露糖代謝通路、血小板激活代謝通路、黏附連接代謝通路和氮代謝通路。

表1 差異表達蛋白與損傷時間、JOA評分的相關性Tab. 1 Correlation analysis between differentially proteins and time of injury，JOA score

表2 GO分子功能分類Tab. 2 GO molecular functional classification

表3 GO細胞成分分類（2級）Tab. 3 GO cellular component classification（Level 2）

3 討 論

本研究通過研究頸部急性SCI（24 h內）患者與健康人群血液中蛋白質組的差異，篩選出22個表達差異的蛋白質，其中11個蛋白表達上調，且與損傷程度（JOA評分）及損傷時間呈正相關；11個蛋白表達下調，且與損傷程度（JOA評分）及損傷時間呈負相關。并且這些差異表達蛋白主要富集在果糖和甘露糖代謝通路、血小板激活代謝通路、黏附連接代謝通路及氮代謝通路。

關于SCI后繼發性損傷的機制目前有幾種假說：脊髓微循環障礙機制、免疫炎性反應機制、興奮性氨基酸毒性機制、氧自由基過氧化反應損傷機制、鈣離子內流機制等。有多種細胞因子參與上述機制過程，SCI可改變相關蛋白的表達，并將這些蛋白釋放到血液中［5］。

研究發現，SCI會刺激機體發生自身免疫反應，參與反應的細胞有淋巴細胞、中性粒細胞、抗原提呈細胞及吞噬細胞等。這些細胞在SCI后被激活，釋放炎性介質和細胞因子來攻擊靶細胞。SCI后的脫髓鞘反應能激活T細胞，使T細胞表面產生大量的細胞黏附分子，從而易于進入血腦屏障來抑制軸突壞死［6］。而B細胞在SCI后的增殖和活化受到抑制，具體表現為外周血B細胞數量減少，非胸腺依賴性B細胞活化受到抑制［7］。本研究也發現黏附連接代謝通路激活，而B細胞受體信號通路受到抑制，與上述研究結果一致。

本研究發現果糖和甘露糖代謝相關蛋白表達上調，果糖和甘露糖代謝途徑異常激活，說明SCI時中心代謝明顯增強，這與既往報道一致［8-10］。SCI可以引起嚴重的病理生理反應，包括炎性反應、代謝失調和線粒體損傷，而能量損失與神經損傷相關。推測該代謝通路的激活可以歸結于SCI后細胞缺乏能量所致。Carpenter等［11］發現，在果糖和甘露糖代謝通路中，神經元可以利用乳酸作為底物產能。Yan等［12］根據GO分析的結果發現SCI后大部分差異表達蛋白為能量代謝酶。Chen等［13］進一步發現急性SCI后糖酵解途徑中的果糖-二磷酸醛縮酶會明顯升高，且這種酶對神經元有保護作用。此外，碳酸酐酶家族在急性SCI后表達異常升高，考慮和脈管系統的破壞密切相關［3］。

SCI早期會出現脊髓灰質周圍的出血、低灌注、微血栓形成，白質部位髓鞘腫脹。損傷刺激會導致血小板活化因子釋放增多，在SCI的炎性反應和繼發性損傷中發揮毒性作用［14］。肖建如等［15］按損傷程度對SCI患者進行分組及動態觀察，發現各組患者的全血血小板活化因子均有不同程度升高，持續至傷后7 d，全血血小板活化因子含量增高和損傷程度呈正相關。本研究同樣發現，和對照組相比，SCI患者的血小板激活代謝通路表達活躍。

急性SCI還會誘導機體的免疫細胞產生大量一氧化氮合酶，而一氧化氮被認為在繼發性SCI發生機制中起著重要作用。SCI發生后一氧化氮的合成逐漸增加，至傷后12 h達到高峰［16］。本研究亦發現急性SCI后氮代謝通路異常活躍，側面印證了上述報道。

本研究并沒有發現氧化應激蛋白或軸突生長相關蛋白的表達異常，這可能和本研究選取的時間點較早（損傷后24 h之內）有關。據報道，急性SCI中重要的氧化應激蛋白之一谷胱甘肽S轉移酶一般在傷后24 h出現，而與軸突生長相關的蛋白出現得更晚一些［3，17］。

綜上，本研究通過對急性SCI患者及健康人群的血清蛋白質組學進行分析，發現急性SCI后果糖和甘露糖代謝通路、血小板激活代謝通路、黏附連接代謝通路及氮代謝通路活躍，B細胞受體信號代謝通路則受到抑制。果糖-二磷酸醛縮酶、碳酸酐酶等有望成為急性SCI潛在的分子標志物，為后續評估急性SCI病情進展及病理機制提供了一定依據。