食管癌細胞中Let-7miRNA表達對CD8+T影響分析

譚 遙 盧 喜 吳萬艷 帕力達·阿皮孜阿吉 伊斯刊達爾·阿不力米提

食管癌(esophageal cancinoma)是常見的消化系統惡性腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發病第8位，惡性腫瘤死亡的第8位，2017《中國腫瘤年報》報道，食管癌在我國惡性腫瘤的發病率和死亡率均位列第四位，惡性程度極高，嚴重危害人類健康[1]。Let-7miRNA是目前已知的最大的miRNA家族，以往let-7miRNA被認為是一種抑癌基因[2]，在食管癌細胞中表達水平較低，參與食管癌細胞周期、細胞分裂相關的基因調控，抑制腫瘤血管生成、影響癌細胞的侵襲能力，食管癌中持續let-7miRNA低表達被認為是預后較差的因素之一[3-7]。然而近期的研究提示let-7miRNA可能與細胞免疫功能調節密切相關，Elena等[8]團隊發現，let-7miRNA可能是細胞免疫的重要調節分子，T淋巴細胞幼稚狀態的維持需要較高水平的let-7miRNA，活化的CD8+T細胞中的表達水平顯著減低，通過調整其表達，可以調節CD8+T的增殖和活化。Baer等[9]的團隊也發現，降低腫瘤相關巨噬細胞中let-7miRNA的表達可以激活抗腫瘤免疫反應，抑制腫瘤細胞生長。細胞免疫功能下降一直被認為是腫瘤細胞逃避免疫監視的原因之一，免疫治療也成為近年來的研究熱點，其在傳統治療外為腫瘤患者尋找更多的治療方案。本文通過體外細胞實驗，初步探索食管癌細胞中let-7miRNA表達水平對CD8+T細胞活化及功能的影響，結果如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

采用正常食管鱗狀上皮細胞系HEsEpiC，食管鱗狀細胞癌系Eca109，食管鱗狀細胞癌系TE-1。HEsEpiC用含10%胎牛血清的EpiCM培養液，TE-1及Eca109用含10%胎牛血清的DMEM培養液，均在37 ℃、5%CO2恒溫培養箱孵育，待細胞生長至80%融合狀態，用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞。

1.2 RNA提取及let-7miRNA檢測

RNA提取：Trizol試劑提取總RNA，整個操作過程均在冰上進行，提取的RNA分光光度儀測OD值確定RNA質量及完整性。

Let-7miRNA檢測：分別取HEsEpiC、Eca109、TE-1總RNA 2 μg，采用let-7和U6(內參)的反轉錄引物進行逆轉錄反應，獲得cDNA作為模板，熒光實時聚合酶鏈反應(quantitative Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction qRT-PCR)技術檢測let-7miRNA表達。每個樣本均設3個平行孔，反應參數為95 ℃預變性30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，熒光檢測，反應40個循環。并繪制溶解曲線，記錄每個反應管中的熒光信號到達所設定的域值時所經歷的循環數即Ct值，以2-△△ct法來計算正常食管鱗狀上皮細胞系與食管鱗癌細胞系中的let-7miRNA表達量比值。

1.3 Let-7miRNA表達差異對CD8+T細胞激活影響

1.3.1 外周血單個核細胞提取 5名健康志愿者空腹抽取肘靜脈外周血5 ml，肝素鈉抗凝，密度梯度離心法提取外周血單個核細胞(PBMC)，置于10% 胎牛血清(FBS) 1640培養液中，5%CO2，37 ℃孵育箱中備用。

1.3.2 Let-7inhibitor、Let-7mimic細胞建立 提前一天將TE-1細胞接種于12孔板，1×105個/孔；轉染前，棄去培養基，加入800 μl Opti-MEM培養基；13 μl轉染試劑Hyperfect 2000及2.5 μg 質粒或mimic、NC、inhibitor(50 nM)加入到含200 μl Opti-MEM的RNase free中，漩渦振蕩混勻，室溫靜止10～15 min；將混和液加入到12孔板中，細胞培養箱中培養6 h；更換培養基，37 ℃5% CO2孵育48 h。

1.3.3 共培養體系CD8+T細胞活化及效應因子檢測

取TE-1、let-7inhibitor、let-7mimic與PBMC共同培養反應體系各100 μl(1∶50，24 h)。采用FITC anti-human CD8a Antibody、PE anti-human CD71 Antibody、PE anti-human CD69 Antibody表面染色4 ℃孵育20 min，洗滌2次，離心，去上清；100 μl PBS和300 μl 4%多聚甲醛，4 ℃固定25 min；破膜液破膜、離心，去上清，PBS洗滌2次，PE anti-human IFN-γ Antibody、PE anti-human Perforin Antibody，4 ℃避光孵育30 min，洗滌2次；PBS制備細胞懸液，BD FACSCalibur檢測。

1.4 統計分析

Let-7miRNA表達以均數±標準差表示，差異采用Graphpad Prism6，Demo軟件進行統計分析，CD8+T細胞CD71，CD69，IFN-γ,Perforin差異分析采用Florjo 7.6.1軟件分析，所有實驗均重復3次。

2 結果

2.1 Let-7miRNA表達差異

分別檢測HEsEpiC、Eca109、TE-1 細胞中let-7miRNA轉錄水平，HEsEpiC(16.11±2.073)，Eca109(1.67±0.912)、TE-1(1.01±0.123)，Eca109、TE-1腫瘤細胞let-7miRNA表達水平均顯著低于正常食管上皮細胞(P=0.007，0.000)，食管癌細胞株的let-7miRNA處于低表達狀態(圖1)。

圖1 HEsEpiC、Eca109、TE-1 細胞中let-7miRNA表達

2.2 Let-7miRNA表達對CD8+T細胞活化影響

細胞轉染法干擾TE-1細胞系let-7miRNA表達，不同表達組分別于PBMC共同培養24 h，檢測不同培養系中CD8+T細胞活化相關分子CD69、CD71表達，Control與inhibitor未見顯著差異(P=0.058,0.160)、inhibitor與mimc組，control與mimc組間，CD69、CD71表達差異存在顯著差異(P=0.003，0.007和P=0.000，0.001)(圖2、3)，食管癌細胞中let-7miRNA表達水平與CD8+T細胞活化能力呈正相關，能促進CD8+T細胞的激活。

圖2 Let-7miRNA表達水平對CD8+T CD69表達影響

圖3 Let-7miRNA表達水平對CD8+T CD71表達影響

2.3 Let-7miRNA表達對CD8+T細胞效應影響

分別取let-7miRNA表達共培養體系，檢測不同培養系中CD8+T細胞效應相關產物干擾素-γ(IFN-γ)，穿孔素(Perforin)的表達，IFN-γ在mimic組中的表達高于對照組和抑制組(P=0.023，0.001)，在三組中為最高；模擬組中穿孔素也顯著高于其他兩組，抑制組中IFN-γ、穿孔素表達均為3個中最低(P=0.006，0.000)(圖4)。食管癌腫瘤細胞中的let-7miRNA表達水平可以影響CD8+T細胞效應分子分泌，進而影響CD8+T細胞殺傷功能。

圖4 Let-7miRNA表達水平對CD8+T分泌IFN-γ，Perforin的影響

3 討論

食管癌是最常見的消化系統腫瘤之一，在發展中國家發病率顯著高于發達國家，2013年全球死于食管癌的為440 000人[1]。我國是世界上食管癌發病率和死亡率最高的國家之一，年平均死亡率為14.59/10萬[10]。目前食管癌的治療仍以手術、放療、化療為主，經過幾十年的改進，療效仍不盡如人意，晚期食管癌的5年總生存率(overall survival,OS)徘徊在15%～20%之間，根治性的放療、同步放化療等治療手段在一定程度上改善了預后，5年0S提高至40%～47%[11-12]。新的治療途徑，尤其是免疫治療的興起，讓我們看到了食管癌治療的希望，目前已經有將PD-1、PD-L1用于食管癌治療的臨床實驗，有望改善食管癌的預后[13-15]，對新的免疫調節點的研究也從未停止過。

Let-7miRNA作為1個古老的RNA家族，人們一直在探索其功能，既往的研究主要集中于其抑癌的作用方面，認為其在腫瘤中存在低表達的情況，在乳腺癌、肺癌中的表達水平可能與預后直接相關，食管癌中的持續低表達可能提示預后不良[4-5,16-17]。在腫瘤分發生和發展過程中，let-7miRNA靶向調節的癌基因在成熟的組織中不表達或者低表達，但在腫瘤形成過程中出現表達或者表達升高。在白血病和前列腺癌的研究中又得到了不同的結果[18]。除此之外，也有研究提示let-7miRNA調控的靶基因產物高遷移率蛋白A1,A2(high mobility group A1,A2 HMGA1,HMGA2)與腫瘤的遷移能力密切相關，在乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤中存在顯著高表達狀態[7,19-20]。同時，let-7miRNA也可以通過調整細胞周期蛋白D2(cyclinD2，CCND2)使腫瘤細胞停止在G1/S階段。在不同類型腫瘤的發生發展中作用機制不盡相同，參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、分化的過程[21]。近期的一些研究欣喜的發現let-7miRNA在細胞免疫方面也有作用，Zhang等[22]報道let-7miRNA可以調節CD62-L、CD69表達，從而影響CD8+T細胞的遷移能力。Elena等[8]則發現，維持幼稚的淋巴細胞狀態，需要高水平的let-7miRNA表達，細胞成熟后表達則顯著降低，通過改變CD8+T細胞中let-7miRNA的表達水平，可以觀察到其增殖、分化和功能的變化，let-7miRNA可能是CD8+T細胞免疫調節的潛在位點，進一步的研究也發現這種調節機制可能是激活Eomes的靶基因實現的。

本研究檢測了較為常見的食管癌Eca109、TE-1細胞株中的let-7miRNA的表達水平并與正常食管上皮細胞HEsEpiC進行比較，證實其在食管癌細胞中的低表達。進一步選取表達水平居中的TE-1，采用細胞轉染的方法改變其let-7miRNA表達水平，并與志愿者PBMC共同培養，通過檢測與CD8+T細胞活化相關的CD69、CD71，殺傷功能相關的IFN-γ，Perforin的水平[23],初步分析食管癌細胞中let-7miRNA表達對CD8+T細胞的影響。結果顯示，let-7miRNA水平的升高可以促進CD8+T細胞的活化并提高其細胞殺傷功能。let-7miRNA高表達組培養體系中CD8+T中細胞CD69、CD71及IFN-γ，Perforin的表達水平顯著高于對照組和低表達組，低表達組的相應細胞因子及效應分子則明顯降低，提示其表達與CD8+T細胞的活化和功能水平呈正相關。這一現象與let-7miRNA調節CD8+T細胞激活和功能的研究結論相似，提示食管癌細胞中let-7miRNA表達水平降低可能是其在腫瘤形成過程中逃逸機體免疫監視的途徑之一。也間接的印證了持續低表達的食管癌患者預后差的可能原因，由于本研究是在體外細胞水平進行，有一定的局限性，進一步在食管癌患者組織標本及血液標本中檢測let-7miRNA的表達水平，并研究其相關的靶基因和細胞通路分子在患者體內的表達情況，有望更加深入的揭示其作用機制。

本研究通過體外細胞實驗初步探討了let-7miRNA表達對細胞免疫的影響。在食管癌細胞中，let-7miRNA的表達水平與CD8+T細胞活化和殺傷功能呈正相關。Let-7miRNA可能是食管癌患者細胞免疫的潛在調節位點之一，值得進一步深入研究。