牛欄山白酒釀造過程中扣囊復膜酵母的分離與產物分析

郝文軍，劉紅霞，于曉濤，李艷敏，孫海波，朱婷婷，王英杰，魏金旺

（北京順鑫農業股份有限公司牛欄山酒廠，北京101300）

扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera），也稱擬內孢霉，是清香型白酒酒曲的主要上霉微生物，也是酒醅發酵階段重要的功能性微生物[1]。劉志磊等[2]通過對清香型大曲和酒醅中的酵母類微生物鑒定后發現1株肋狀擬內孢霉，與模式菌株Saccharomycopsis fibuligera s5b-2相似度達99.31%。胡建華等[3]從牛欄山清香型白酒大曲及酒醅中分離得到3株擬內孢霉，并成功應用到醇甜基酒生產中，但對擬內孢霉產生的醇甜成分沒有進行深入分析；陳蕾等[4]研究發現，陸地扣囊復膜酵母具有高活力的淀粉酶，能水解α-1,4糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵；張志才[5]將扣囊復膜酵母制成麩曲，使前期發酵醪溫度上升1℃，出酒率提高。目前，對扣囊復膜酵母的研究多集中在菌種鑒定和相應酶活的研究上，對其代謝產物的研究還鮮有報道。本試驗旨在對牛欄山清香型大曲和酒醅進行常規微生物分離，從而獲得扣囊復膜酵母菌株，并分析其代謝產物及與牛欄山二鍋頭白酒的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清香酒醅：取自牛欄山酒廠釀酒車間。

主要試劑：酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂，北京奧博星生物技術有限公司；葡萄糖，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SPX-430型生化培養箱，寧波江南儀器廠；TD-2002B型電子天平，余姚金諾天平儀器有限公司；YXQ-LS-75Ⅱ型壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；7890B-5977B氣質聯用儀，安捷倫科技有限公司。

1.3 培養基的制備

YPD培養基：酵母浸粉10 g、葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、瓊脂20 g、水1000 mL，115 ℃，滅菌30 min，倒平板備用。

高粱培養基：高粱，4瓣、6瓣、8瓣粉碎，70%沸水潤糧24 h，分裝入500 mL三角瓶中，每瓶100 g，121℃滅菌蒸糧30 min，趁熱搖散，降溫備用。

1.4 扣囊復膜酵母的分離與純化

稱取5 g清香酒醅，放入裝有45 mL無菌水的三角瓶中，搖床振蕩20 min形成混懸液；移液器吸取1 mL混懸液加入到裝有9 mL無菌水的試管中，搖勻為10-2濃度；依次從試管中吸取1 mL混懸液，加入到9 mL無菌水的試管中，配制成10-3、10-4、10-5、10-6濃度梯度。分別取10-4、10-5、10-6混懸液在YPD平板上進行微生物涂布分離，置于28℃下培養72 h，觀察菌落形態并從中挑取形態不同的扣囊復膜酵母進行平板純化，直到得到相應的純菌落為止。

1.5 扣囊復膜酵母的培養

挑取1環不同的純菌落，分別置于裝有2 mL無菌水的小試管中，攪勻得到菌懸液，將該菌懸液倒入裝有高粱培養基的三角瓶中，搖拌均勻，置于28℃培養箱中培養，中途搖瓶數次。對照樣為不接種的純高粱培養基。

1.6 扣囊復膜酵母香氣跟蹤

通過鼻子聞香的方式對培養第7天和第13天的扣囊復膜酵母的香氣變化情況進行跟蹤。

1.7 扣囊復膜酵母在高粱培養基中生長后代謝產物的測定

準確稱取1 g高粱培養基于20 mL頂空瓶中，加入8 mL純凈水，然后加入3 g NaCl，內標（丙酸辛酯和薄荷醇混標的濃度分別為60.55 ppb和125.2 ppb）10 μL。頂空固相微萃取進樣，具體條件如下。

進樣方式頂空自動進樣；進樣口：無分流進樣。

萃取頭：三項纖維萃取頭。頂空溫度：50℃；浸提時間：40 min。

色譜柱：DB-FFAP122-3262，最高溫度250℃，60.0 m×0.25 mm×0.25 μm。載氣流量2 mL/min。

升溫程序：50℃（2 min）→4℃/min→230℃（15 min）。

離子源電壓：70 eV；離子源溫度：230℃；四級桿溫度：150℃；輔助加熱區溫度：280℃。

質量掃描范圍：35.0～350.0。

2 結果與分析

2.1 扣囊復膜酵母的菌落形態（圖1）

圖1 不同扣囊復膜酵母的菌落形態

用接種針挑取少量菌體接種在相同的YPD平板上培養48 h，形成單菌落，見圖1，菌落順序從左向右依次編號為SF1、SF2、SF3、SF4、SF5。從圖1可以看出，SF1—SF5菌落形態存在明顯差異。SF1為乳白色菌落，形態呈不規則狀，向上突起形成巨大褶皺，長滿微小絨毛，不易挑取；SF2為暗白色菌落，形態呈向上突起的圓形，長滿微小絨毛并向四周輻射生長，不易挑取；SF3為雪白色菌落，形態呈不規則圓形，向上隆起，中間扁平，長滿細小絨毛，并向外輻射生長，不易挑取；SF4為雪白色菌落，形態呈不規則圓形，微向上隆起并伴有多條長線狀突起，中間扁平，長滿微小絨毛，不易挑取；SF5為乳白色菌落，形態不規則，向上隆起，長滿致密的絨毛，不易挑取。

2.2 培養時間及方式的選擇

通過早期實驗對不同發酵時間的牛欄山清香型酒醅進行跟蹤得知，扣囊復膜酵母在入池的前3天開始大量繁殖，而后數量出現小幅度的下降和再上升的態勢，發酵7 d后，扣囊復膜酵母數量開始大幅度下降，直到第13天基本全部死亡，這與酒醅中氧含量有直接關系。根據這一規律，將這5株菌的培養條件進行適當調整，前7天使用透氣的封口膜密封三角瓶，可見高粱表面長滿白色的扣囊復膜酵母菌體；7 d后改為保鮮膜密封培養，使三角瓶內氧氣逐漸被消耗完，第13天結束培養。

2.3 扣囊復膜酵母在高粱培養基中的香氣分析（表1）

表1 不同扣囊復膜酵母在高粱培養基中的香氣變化

根據2.2中所述的扣囊復膜酵母在酒醅的變化規律，將第7天、第13天定為兩個關鍵點，通過用鼻聞,判斷這5株菌的香氣變化情況，初步確定培養基中是否有呈香化合物生成。從表1可以看出，SF1的香氣在第7天時呈現較強的水果香氣，第13天伴隨出現令人不愉快的臭味；SF2、SF4在第7天時散發出不愉快的臭味，但第13天時伴隨出現較弱的果香；SF3在第7天時水果香較強烈，第13天時果香減弱，出現淡淡的不愉快的臭味；而SF5在第7天時水果香較淡，第13天時果香消失，出現令人不愉快的臭味。綜合分析，5株扣囊復膜酵母在培養7 d和13 d時，均出現明顯的香氣變化，這說明培養基中確實有呈香化合物生成。

2.4 扣囊復膜酵母在高粱培養基中的代謝產物分析（表2）

為了確定扣囊復膜酵母代謝生成的化合物類型，實驗利用氣質聯用儀對培養13 d的扣囊復膜酵母培養基進行微量成分的半定量分析。從表2可以看出，扣囊復膜酵母在高粱培養基中生長繁殖時，確實可以代謝生成多種化合物，其中包括9種酯類化合物、5種內酯類化合物、7種醇類化合物、9種萘酚類化合物、7種酸類化合物、4種醛酮類化合物，這些化合物中多數都呈現出特殊香氣。

王勇等[7]等利用GC-O和GC-MS技術分析牛欄山二鍋頭白酒，一次性檢測出92種香氣化合物，其中有25種香氣成分對白酒整體香氣貢獻最大。通過成分對比發現，上述5株扣囊復膜酵母的代謝產物中，有6種化合物是牛欄山二鍋頭白酒中重要的香氣成分，分別是苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醛、4-乙基愈創木酚、3-甲基丁酸、苯乙酸[7]。苯乙酸乙酯具有濃烈而甜的蜂蜜香氣；乙酸苯乙酯帶有粉香的蜂蜜樣香氣，類似蘋果樣的果香；苯乙醛具有濃郁的玉簪花香氣，稀釋后有類似水果的甜香氣；4-乙基愈創木酚帶有香瓜香；苯乙酸在低濃度時具有甜蜂蜜味；3-甲基丁酸有刺激性酸敗的臭味，高度稀釋后則有甜潤的果香。表2中數值顯示，5株扣囊復膜酵母在第13天的檢測中，培養基中的3-甲基丁酸積累量最大，推測是造成扣囊復膜酵母在聞香時伴有令人不愉快臭味的重要因素之一。

扣囊復膜酵母作為牛欄山清香型酒醅中的主要優勢微生物，其代謝產生的多種呈香化合物與牛欄山二鍋頭白酒的重要香氣化合物重合，由此可以推斷，扣囊復膜酵母在牛欄山二鍋頭白酒的釀造過程中起著很重要的作用。

表2 13 d時扣囊復膜酵母代謝產物半定量分析

3 結論

通過對牛欄山清香型酒醅分離，得到5株菌落形態不同的扣囊復膜酵母，編號為SF1、SF2、SF3、SF4、SF5。對這5株菌進行純培養后發現，在第7天和第13天時，這5株菌在香氣方面發生明顯改變；通過對培養基中代謝產物半定量分析發現，扣囊復膜酵母可以代謝生成多種化合物，其中有6種化合物是牛欄山二鍋頭白酒中重要的香氣成分，分別是苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醛、4-乙基愈創木酚、3-甲基丁酸、苯乙酸，可以推測，扣囊復膜酵母在牛欄山二鍋頭白酒的釀造過程中起著很重要的作用。