釀酒酵母的篩選及發酵性能的比較

黃媛媛

(上海金楓酒業股份有限公司，上海201501)

黃酒是中國歷史最悠久的酒種，是以稻米、黍米等為主要原料，經加曲（或部分酶制劑）、酵母等糖化發酵劑釀制而成的發酵酒。在黃酒釀造中，酵母是主要發酵劑，能分解碳水化合物產生酒精和二氧化碳等，其發酵性能的優劣直接影響到黃酒的品質和出酒率[1-3]。目前國內酒廠主要使用購買的酒藥或活性干酵母，或從黃酒發酵醪中分離篩選出性能優良的釀酒酵母。本研究從兩種不同來源的黃酒發酵醪和活性干酵母中分離出15株酵母，通過TTC法和CO2失重法篩選出性能優良的3株酵母進行釀酒試驗。對這3株酵母的產酒精能力、產酸能力以及發酵液中殘余總糖、氨基酸態氮、揮發性風味物質等含量進行了綜合比較[4-6]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種、試劑

菌源來自本公司的黃酒發酵醪、紹興某廠的黃酒發酵醪、安琪酵母股份有限公司的活性干酵母；試劑：無水酒精和NaCl為A.R.級，其余標樣均為GC級。

1.1.2 培養基

麥芽汁培養基：麥芽汁，pH4.5，121℃滅菌20min。麥芽汁固體培養基：麥芽汁12～13°Bx，pH5.0～6.0，瓊脂2.5%，121 ℃滅菌20 min。

TTC培養基：上層：2,3,5－三苯基氯化四氮唑0.05%，葡萄糖0.5%、瓊脂1.5%、蒸餾水100%；下層：12～13°Bx的麥芽瓊脂汁培養，121℃滅菌20min。

大米糖化液：大米100%，水300%，曲5%，50～60℃糖化3～4 h過濾即可得到糖度為18°Bx左右的大米糖化液，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

高壓滅菌鍋；恒溫培養箱；超凈臺。

電位滴定儀785，Metrohm瑞士萬通；酒精計，上海華辰醫用儀表有限公司。

氣相色譜儀為agilent6890N；色譜柱DB-WAX 30 m×0.32 mm×0.25 μm；頂空進樣器HP-7694E。

1.3 試驗方法

1.3.1 釀酒酵母的初篩

TTC篩選法：TTC與酵母菌的代謝產物發生顯色反應，呈紅色的菌落為產酒高的釀酒酵母，粉紅色菌落次之，微紅或白色菌落為野生酵母。

取安琪酵母1 g，在無菌條件下，加入麥芽汁液體培養基28℃培養24 h。然后取其培養液以及本公司、紹興某廠的黃酒發酵醅各1 mL，在無菌條件下，逐級稀釋涂布于麥芽汁平板培養基，每個稀釋梯度平行做兩個樣，以28℃恒溫培養48 h，待形成單個菌落時挑取其中的單個菌落劃線分離，將純菌種接種到試管斜面固體培養基并于4℃冰箱中保存。

將分離的斜面菌株一一對應涂布于TTC底層培養基上，并于28℃恒溫箱中培養48 h左右。將溫度已冷卻為45～50℃的上層培養基倒在下層培養基上，于30℃無光條件下培養2～4 h后，取出立即觀察顏色，根據菌落呈色情況挑選菌種。

1.3.2 釀酒酵母的復篩

CO2失重法：在500 mL角瓶中，裝入400 mL 12～13°Bx的大米糖化液。滅菌冷卻后，接入經24 h培養的液體菌種5 mL。稱重記錄原始重量，28℃培養，每隔24 h稱重1次，及時了解發酵速度和失重情況，待發酵終止測總失重量，以及還原糖、酒精度、總酸、氨基酸態氮、pH值。檢測方法參見國標GB/T 13662—2008。

1.3.3 發酵性能的比較

將復篩得到的酵母進行釀酒試驗，對比3種不同來源的酵母的發酵性能。試驗配方為：糯米15 kg、酒母1.2 kg、曲2.0 kg、水16 kg、α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶各3 mL。

1.4 分析方法

揮發性風味物質：采用毛細管氣相色譜并結合自動靜態頂空進樣技術。

2 結果與討論

2.1 初篩和復篩

經TTC法篩選出15株酵母菌株后，經CO2失重法復篩，并對其進行編號為J-1至J-5（源自本公司黃酒發酵醅），S-1至S-5（源自紹興某廠的黃酒發酵醅），A-1至A-5（源自活性干酵母）。15株酵母菌的CO2總失重和發酵醪的理化指標結果見表l。由表1可看出，菌株J4、S1、A4產酒精能力較強，而且發酵醪的總酸和總糖含量也較低，說明這3株酵母的發酵能力較強。同時，這3種不同來源而篩選出的酵母發酵性能也不同，酵母J前48 h的CO2失重最多，說明起發速度快，不易染雜菌，總酸也較低；酵母S產酒精能力相對較弱，但產酸能力最強，平均為5.17 g/L；而酵母A產酒精能力最強，平均為12.2%vol，殘余總糖也最低，平均為7.0 g/L，酵母發酵消耗糖生產酒精，殘余總糖越低則酒精度相對越高。

2.2 發酵性能的比較

2.2.1 產酒精能力的比較

發酵過程中酒精度的變化結果見圖1，結果表明：酵母J4起發速度最快，1 d時酒精度就能達到11.6%vol，產酒精能力最強，最終可達19.0%vol；而酵母A4次之，1 d時酒精度為10.7%vol，最終為18.9%vol；酵母S1最弱；1 d時酒精度為9.7%vol，最終為18.7%vol。

2.2.2 殘余總糖的比較

發酵過程中殘余總糖的變化結果見圖2，結果表明，酵母A4、J4、S1糖利用率都較高，發酵液中的殘余總糖都較低，分別為1.9 g/L、2.2 g/L、2.4 g/L，但是酵母S1糖利用的速度較慢。發酵液中的殘余總糖反映酵母將糖轉化成酒精的能力，如果初始糖含量相同，發酵結束后殘糖量低，說明酵母對糖的轉化利用率高，酒精度高，發酵能力強。

表1 15株酵母發酵醪失重及最后發酵醪理化指標結果

圖1 產酒精能力的比較

圖2 殘余總糖的比較

2.2.3 產酸能力的比較

發酵過程中總酸的變化結果見圖3，結果表明，酵母S1總酸最高，可達4.95 g/L，說明其產酸能力最強。酵母A4的總酸為4.77 g/L，酵母J4的總酸為4.50 g/L，產酸能力最弱。酸類物質是黃酒中重要的風味物質，在黃酒中有增加濃厚感和減少甜味的作用。所以總酸含量要適中，否則會影響黃酒的口感和風味。

圖3 產酸能力的比較

2.2.4 氨基酸態氮含量的比較

黃酒中含有20多種氨基酸，大多具有酸、甜、苦、咸、鮮等味道，賦予黃酒豐富的味覺層次；能被酵母進一步代謝生成重要的風味物質高級醇，還能與糖發生美拉德反應，是黃酒色澤的重要來源[7-9]。發酵過程中氨基酸態氮的變化結果見圖4，結果表明：酵母A4和J4的氨基酸態氮含量都較高，可達0.92 g/L，酵母S1的氨基酸態氮含量為0.75 g/L。

圖4 氨基酸態氮含量的比較

2.3 揮發性風味物質的檢測與分析

黃酒的揮發性風味物質由多種微量成分組合而成，包括醇、酯、醛、酸以及各種雜環類化合物等。酯類物質主要是乳酸乙酯、乙酸乙酯等，共同形成水果香氣，對黃酒陳香有很好的襯托作用。醛類物質主要是乙醛以及乙醛和乙醇縮合而成的乙縮醛等，具有清醇的果香味，也就是黃酒的陳香氣[10-11]。醇類物質主要是β-苯乙醇、異丁醇、異戊醇等，尤其是含量較高的β-苯乙醇，具有玫瑰花香、清甜蜜樣的香氣[12]。對3種酵母的發酵液進行了部分揮發性風味物質的檢測，結果見表2。

表2 部分揮發性風味物質的檢測結果 (mg/L)

根據上述檢測結果，對酯類的總和、高級醇和β-苯乙醇做了進一步對比分析，如圖5所示。酵母S1的高級醇含量最高，為347.9 mg/L，同時，總酯含量也最高，為46.5 mg/L。高級醇構成了黃酒特有的香氣骨架，但是，據相關研究表明，黃酒中的高級醇含量遠遠大于其他釀造酒，而飲用黃酒引起上頭的主要原因是黃酒中高含量的高級醇[13]。高級醇在黃酒中正常的生成和合理的存在對酒質呈香呈味有很好的積極作用，但若含量過高，會影響酒質并對人體產生危害，所以必須要嚴格控制高級醇的含量[14-15]。酵母A4的β-苯乙醇含量最高，為117.1 mg/L，同時高級醇含量最低，為310.4 mg/L?？傰ズ挺?苯乙醇含量高對黃酒在后續陳釀過程的香氣形成有較大貢獻，使黃酒醇香濃郁。

圖5 總酯、高級醇、β-苯乙醇含量的對比結果

3 結論

通過TTC法、CO2失重法、釀酒試驗篩選出性能優良的3株酵母：S1、A4、J4，都具備發酵能力較強、性能穩定、產酸量適中等特點，符合釀造黃酒對優良酵母菌種的要求，可以用到黃酒生產中以提高黃酒的品質。其中從本公司發酵醪篩選出的酵母J4產酒精能力最強，從紹興某酒廠發酵醪篩選出的酵母S1產酯能力最強，而從安琪公司的活性干酵母中篩選出的酵母A4產β-苯乙醇高、產高級醇低。3株酵母來源不同，各有特色，在黃酒生產中可以復合使用這3種酵母，以達到提高黃酒產量、質量和風味的目的，其復合添加比例以及生產工藝有待進一步研究。