口腔鱗狀細胞癌中MAPK8基因的表達及意義

崔宇平 馬洪 段曉峰

據統計，世界上常見的癌癥之一就是口腔癌，全球平均每年臨床上確診的發病人數約500～600 萬人，主要以發展中國家及欠發達地區人群為主要的患病群體，晚期口腔癌的患者5 年存活率約為10%～30%)[1-2]，在中國， 10 萬名癌癥患者中口腔癌的發病率大約在3.6～8.0 萬人之間。相關研究表明，口腔癌基因被激活并發展是由多種因素、多種環境共同參與產生的結果[3]。近年來，細絲裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)基因在人體的多個部位的腫瘤組織中均呈現高表達的狀態，比如肝癌，胃癌，胰腺癌等等。本研究利用Real Time PCR方法及免疫組織化學技術檢測MAPK8 mRNA分別在正常口腔黏膜組織及口腔鱗狀細胞癌(OSCC)中的表達情況，并探討在不同臨床表現的OSCC病例中MAPK8mRNA的表達差異，為OSCC的早期診斷提供數據支持。

1 資料與方法

1.1 標本來源

標本來自貴州醫科大學附屬醫院及貴州省腫瘤醫院的口腔頜面外科手術過程中進行切除的口腔組織，所有采集標本患者的年齡均大于18 周歲，患者術前檢查均無全身系統性疾病;在自拔牙患者口腔中采集正常黏膜組織。所有42 例OSCC組織及17 例正常組織,離體后等分成2 份，其中一塊立即用RNA later液暫封, 4 ℃冰箱過夜， -80 ℃冰箱保存，另外一塊組織放入裝有4%甲醛溶液的玻璃瓶里，浸泡在液體內部，常溫保存待用。收集時間 2016-06～2017-01。

1.2 引物合成

根據參考文獻確定內參基因序列及引物[4]。MAPK8，上游序列：gggcagccctctccttta；下游序列：cattgacagacgacgatgatg。內參基因GAPDH，上游序列：cttagcacccctggccaag；下游序列: gatgttctggagagccccg。

1.3 主要試劑與方法

1.3.1 Real-time PCR 取3 mm×3 mm左右體積的組織，利用磁珠法提取mRNA, 使用美國Roche公司的Dynabeads Rm-RNA DIRECTTM試劑盒，再利用Roche的Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒進行逆轉錄操作，然后進行擴增操作，利用10 μl反應體系:上下游引物4.0 μl,模板1 μl。預變性95 ℃, 1 min;變性95 ℃, 10 s; 退火65 ℃, 30 s, 共64 個循環。每個樣品7 個復孔,取CT平均值,采用 2-△△CT法進行結果分析。

1.3.2 免疫組織化學染色SP法 常規甲醛溶液進行固定后進行組織蠟塊連續切片，按照SP免疫組化二抗試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)說明書進行染色。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 RT-PCR結果分析

OSCC患者與口腔正常黏膜組織患者的相對表達量分別為: 0.040 3±0.027 5和1.308 7±0.734 5,t=11.172,P<0.05。其中OSCC組織中,不同臨床特征間比較結果如表 1所示。

2.2 免疫組織化學染色結果分析

正常口腔黏膜組織中未見明顯黃染，OSCC組織中MAPK8陽性著色主要位于細胞質(圖 1A～1C)，在高分化OSCC組織中，可見細胞質黃染，細胞核未見明顯著色，在中低分化OSCC組織中，細胞質黃染程度略微高于高分化OSCC組織，細胞核略微著淡黃色。由病理科醫生在雙盲條件下，在鏡下隨機取10 個陽性視野，用平均光密度法(Mean Optical Density，MOD)來分析染色結果。免疫組織化學檢測MAPK8基因的表達情況見下表 2～3。

表 1 MAPK8 mRNA在OSCC中不同臨床特征的相對表達量Tab 1 Association between MAPK8 mRNA expression and clinical characteristics of OSCC

圖 1 MAPK8蛋白質在正常口腔黏膜和OSCC中的表達(SP，×200)Fig 1 MAPK8 protein expression in normal oral mucosa tissues and OSCC(SP，×200)

表 2 MAPK8蛋白在OSCC及正常黏膜組織中的表達Tab 2 The expression of MAPK8 protein in the normal oral mucosa tissues and OSCC

3 討 論

MAPK家族信號通路是一種將外界的刺激或者信號通過一系列的反應使通路激活， 從而傳導信號致細胞核內，使某個基因在轉錄過程中提高活性，進一步生成相應的蛋白質[5]，MAPK家族信號通路有蛋白激酶、c-JunN端激酶(JNK)等途徑，不同的刺激因素激活MAPK信號通路從而形成不同的傳導通路，進一步激活相應的轉錄因子，介導后續的生物學效應。最初在細胞核內發現轉錄因子c-Jun， MAPK8對其有特異性磷酸化的作用， 是c-Jun的激酶， 所以又把MAPK8稱作c-Jun氨基末端激酶，當某種刺激因素激活MAPK8信號通路后，使MAP3ks活化，進一步激活MKK4，從而使MAPK8磷酸化，磷酸化后的MAPK8和細胞核內的轉錄因子ATF2相結合，結合以后活化的MAPK8使與之結合的轉錄因子的活性區域發生磷酸化，這樣就可以和基因啟動子上的AP-1結合，提高其轉錄活性，促進該基因的表達[6-7]，其功能涉及細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡等各種機制。相關研究表明，MAPK8信號通路與腫瘤細胞的發生發展關系密切，通過磷酸化腫瘤細胞核內的絲氨酸/蘇氨酸位點[8]，使其轉錄活性增強，使腫瘤細胞繼續向惡性的程度繼續發展。

表 3 MAPK8蛋白在OSCC中與不同臨床特征之間的關系Tab 3 Relationship among the clinio-pathologic data with the expression of MAPK8 protein in OSCC

對本次實驗MAPK8免疫組化和MAPK8mRNA相對表達量結果進行分析分析， qPCR和免疫組化結果均一致，結果顯示相對于正常的口腔黏膜組織，在口腔鱗狀細胞癌組織中MAPK8 mRNA的相對表達量和免疫組化MOD值明顯較高，根據其致癌機制分析，可能是某種刺激因素激活MAPK8信號通路，使活化的MAPK8與癌基因的轉錄因子結合并且提高其轉錄活性，進一步使癌細胞進行增殖與分化。本次實驗也研究了MAPK8基因在OSCC中不同臨床特性的關系，在性別的分組中，從分子水平和蛋白水平來看，男性和女性均有差異，但是差異沒有統計學意義，可能說明對于OSCC組織的增殖與分化，性別導致的分泌激素水平的差異對其影響較小，同樣，在對于大于60 歲和小于60 歲的分組研究中，結果雖然有差異，但是也沒有統計學意義，在分化狀態的分組中，隨著口腔鱗癌組織分化程度的降低，MAPK8 mRNA的相對表達量呈現逐漸增加的趨勢，在免疫組化的研究中，分化狀態越低，黃染的程度越強。在對OSCC組織進行臨床分期研究的結果表明，隨著臨床分期的變晚，MAPK8的表達量越高，后兩組統計學結果均有意義，此結果提示MAPK8基因相對表達量的增高對早期口腔黏膜病變和口腔惡性腫瘤患者的預后推斷具有一定意義。MAPK8在OSCC組織中的研究未見相關性的報告，李國東等[9]對于人骨肉瘤的研究指出MAPK8通路被激活以后進而磷酸化下游的c-Jun，從而調節細胞侵襲和轉移相關基因例如uPA和MMPs等的表達，提高細胞的侵襲能力，還有MAPK8通路在各類其他的研究中例如乳腺癌[10]、結腸癌等[11]組織中都有不同程度的MAPK8表達量的增高，其致癌機制均是MAPK8通路先被外界刺激因素激活，轉至細胞核內提高轉錄因子的活性，進一步使癌細胞增殖和分化，和上述文章內所陳述的致癌機制一致。

綜上所述，MAPK8基因在OSCC組織中高表達，并且隨著分化程度越低，臨床分期越晚，MAPK8基因的表達含量越高，所以檢測口腔黏膜MAPK8基因的表達量可以對口腔黏膜的早期病變進行診斷或者預防，同時，MAPK8是否作為口腔鱗狀細胞癌的靶向治療仍需要進一步的研究。