臭氧水對口臭相關細菌的體外抑制效果研究

江靜 黎春暉 聶敏海

口臭主要由口腔微生物(革蘭氏陰性厭氧菌占多數)對口腔中滯留物質腐敗分解引起[1]。同時，口臭給就診患者帶來嚴重的心理負擔和社交障礙。研究表明，口臭主要是由牙周致病菌內含硫氨基酸的代謝產物增加所致，如硫化氫(H2S)、二甲硫醇[(CH3)2S]、甲硫醇(CH3SH)等[2]。口臭致病菌主要是厭氧菌，如牙齦卟啉菌(porphyromonasgingivalis,Pg)、中間普氏菌(prevotellaintermedia,Pi)、具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum,Fn)等[3]。資料顯示，超過80%的口臭患者通常是由多種菌株混合感染所致，且這類菌株在理化特性上極為相似[4]。因此，在研究患者口腔中口臭致病菌時，應先了解感染菌群，有利于后期用藥。

口臭就診患者沒有年齡和性別的區分，病例的分布范圍也較廣。因此，臨床用藥也較為廣泛，最終細菌對某些臨床藥物產生耐藥性。臭氧水具有廣譜殺菌作用，可能具有清除口臭的作用。同時，臭氧水殺菌基本無毒副作用，為臨床上替代抗生素提供新思路。為此，本課題組從西南醫科大學附屬口腔醫院(2017 年)收集到3 株臨床分離株，探討臭氧水的殺菌作用，以期達到除口臭的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料與儀器

1.1.1 試驗菌株 牙齦卟啉單胞菌(Pg)、具核梭桿菌(Fn)及中間普氏菌(Pi)來自2017 年西南醫科大學附屬口腔醫院病人口腔中的分離株。

1.1.2 主要儀器 臭氧發生器(GX-188型，成都肯格王三氧電器設備有限公司)； 潔凈工作臺(SW-CJ-2F，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司)； 厭氧培養箱(YQX-Ⅱ，上海精其儀器有限公司)； 倒置生物顯微鏡(AE31，麥克奧迪實業集團有限公司)； 酶標儀(Multlskan，賽默飛世爾儀器有限公司， 美國)。

1.1.3 試劑 臭氧測定試劑盒(Lot：8304172， 廣東環凱微生物科技有限公司)；革蘭氏染液(規格10 ml×4)；人工唾液(XH-002， 東莞市譽揚檢測儀器有限公司)；細菌基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；BHI血瓊脂平板(廣東環微生物科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌復蘇及傳代 將凍存管(菌株)表面用75%乙醇擦拭后移入潔凈工作臺，分別復蘇后各取100 μl到血平板上涂布培養。置入厭氧培養箱中，設置溫度為37 ℃(10% CO2， 80% N2， 10% H2)。培養3 d后，分別挑取具Fn、Pg、Pi單菌落進行擴增，收集菌體進行試驗。

1.2.2 革蘭氏染色鑒定 用吸水紙將載玻片擦干，在玻片上滴10 μl生理鹽水，接種環灼燒，待其冷卻后，挑取單個菌落均勻涂于玻片的生理鹽水上，待其自然干燥。再通過固定、95%乙醇染色、脫色、復染等，油鏡頭下觀察菌體形態。

1.2.3 PCR鑒定 DNA提取：按試劑盒說明書操作。PCR擴增：引物序列見表 1。

1.2.4 臭氧水的制備及測定方法 在環境溫度為25 ℃的條件下，將臭氧發生器產生的臭氧氣體以多孔砂棒通入盛有250 ml滅菌蒸餾水的具塞三角瓶中，并分別于臭氧水產生的每隔2 min 即2、 4、 6 min……關閉發生器，再用碘量法分別測定各個時間點所對應的臭氧水中臭氧濃度，并測得該臭氧發生器開機所能獲得的最大臭氧水濃度以及獲得最大臭氧水濃度所需的時間。為減小實驗誤差，此實驗中所涉及的測量步驟均需重復3 次，實驗結果取3 次的平均值。

表 1 3 株菌的擴增引物序列Tab 1 The amplification primer sequences of 3 strains of bacteria

1.2.5 臭氧水抑菌試驗 取離心管并按如下方法加入試劑：實驗組離心管中分別加入濃度為0.2、 0.1、 0.05 mg/L的臭氧水4.5 ml，陰性對照組離心管中加入蒸餾水4.5 ml，再分別各組的離心管中加入對應細菌編號的0.5 ml菌懸液，分別作用30 s和60 s，適當稀釋后取10 μl接種于實驗用BHI血瓊脂培養基。在厭氧環境中(80% N2，10% H2，10% CO2)培養48 h后進行菌落數CFU計數，計算出抑菌率，觀察在30 s和60 s作用時間下3 種不同濃度臭氧水的體外抑菌效果。重復實驗3 次，實驗結果取3 次的均值。采用人工唾液模擬正常口腔環境，同樣條件下，觀察臭氧水的抑菌情況。本實驗結果重復3 次，取平均值。

2 結 果

2.1 革蘭染色結果

3 株菌經革蘭染色后，油鏡下觀察可見中間普氏菌(圖 1A)為革蘭陰性球桿菌，牙齦卟啉單胞菌(圖 1B)為革蘭陰性短桿菌，具核梭桿菌(圖 1C)為革蘭陰性梭狀桿菌，形態特點與3 株菌的理論形態相符。

2.2 PCR鑒定結果

3 株菌經PCR鑒定，結果顯示中間普氏菌，牙齦卟啉菌，具核梭桿菌分別在105、 194、 175 bp左右有一條清晰的條帶(圖 2)，與理論相符。

2.3 臭氧水濃度測定結果

在實驗室當時室溫下，采用目前的臭氧水制備條件下制備所得的臭氧水的最大濃度為0.2 mg/L, 對其進行對倍稀釋，獲得3 個濃度分別為0.2、 0.1、 0.05 mg/L的臭氧水備用。

2.4 臭氧水抑菌試驗結果

圖 1 3 種細菌的形態(×1 000)Fig 1 The morphology of the 3 bacteria stains

(×1 000)

1： 中間普氏菌； 2： 牙齦卟啉單胞菌； 3： 具核梭桿菌圖 2 Pi、 Pg、 Fn的16S rDNA PCR條帶譜圖結果Lane 1: Pi; Lane 2: Pg; Lane 3: FnFig 2 The 16SrDNA PCR bands of the 3 bacteria strans

臭氧水抑菌結果顯示，臭氧水在臭氧濃度在0.05、0.1、 0.2 mg/L 3 個濃度時對中間普氏菌，牙齦卟啉菌及具核梭桿菌均具有較好的抑制作用， 隨著臭氧濃度的降低，臭氧水對3 株菌的抑制效果也減弱，具有濃度依賴關系(表 2)。

2.5 人工唾液干擾臭氧水抑菌試驗結果

由表 3可知，在唾液的存在情況下，臭氧水在臭氧濃度為0.2、 0.1、 0.05 mg/L的臭氧水時對中間普氏菌，牙齦卟啉菌及具核梭桿菌均具有一定的抑制作用，同時隨著臭氧濃度的降低，臭氧水對3 株菌的抑制效果也減弱，具有濃度依賴關系。但抑菌作用較單純臭氧水相比顯著降低。

表 2 3 株菌的臭氧水抑菌試驗結果Tab 2 The results of ozone water suppression test of 3 bacteria strains

表 3 人工唾液干擾臭氧水抑菌試驗結果Tab 3 The results of inhibition test of ozone water interfered by artificial saliva

3 討 論

研究發現，牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌及中間普氏菌等與口臭密切相關，郭興懷等[5]抽取43 例口臭患者細菌樣本，檢測發現主要是牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌等構成， 且主要牙周致病菌與口臭程度存在著高度相關性。肖晗等[6]發現，具核梭桿菌通過刺激IL-6的產生促進食管癌細胞的增殖。具核梭桿菌感染可導致腸胃炎，主要是該菌株誘導腸上皮細胞Caco-2凋亡，其具體機制可能與GADD34及GADD153基因表達轉錄水平上調和AKT磷酸化下調密切相關[7]。中間普氏菌是產黑色素類革蘭氏陰性厭氧桿菌，沒有芽孢，是口臭患者十分常見的病原微生物[8]。潘亞萍等[9]通過細菌混合培養發現，口臭患者口腔里的中間普氏菌變形鏈球菌與、血鏈球菌呈拮抗關系，與伴放線放線桿菌和具核梭桿菌呈共生關系。本課題基于3 株菌的嚴重危害性和普遍性，以其為研究對象，進行深入探討。

抗生素可以有效殺死口臭致病菌，達到清除口臭的目的。但近年來，凸顯的耐藥性問題讓不少醫務人員束手無策。因此，抗生素替代產品的挖掘任重道遠。研究表明[10]，臭氧可以殺滅口腔患者中的部分病原微生物，且當臭氧水濃度達到1.3 mg/L時，作用120 s后，對中間普雷沃菌殺菌率可達到100%。臭氧主要是依靠其強氧化性破壞細菌細胞內核酸，如嘌呤和嘧啶，破壞DNA復制，不會產生耐藥性。本研究結果發現，臭氧水具有降低口臭的作用。當臭氧水濃度在0.05、 0.1、 0.2 mg/L時對3 種菌均具有較好的抑制作用，且隨著臭氧濃度的升高，抑制作用加強， 60 s作用效果比30 s強。臭氧水對口臭厭氧菌的作用時間是否與抑制率成線性關系，還需進一步研究證實。

本研究發現，當用人工唾液來模擬口腔環境時，臭氧水抑菌作用降低。證明臨床應用上，臭氧水還需要進一步改進。抑菌作用下降可能與人工唾液中的還原性金屬離子、緩沖液存在等有關，也可能與人工唾液的pH值、唾液流率及微觀成分的變化有關。本課題組將進一步通過臨床試驗來加以探索和研究。

4 結 論

臭氧水能夠對口臭相關細菌產生抑制作用，降低口臭。 0.2 mg/L和0.1 mg/L的臭氧水溶液對3 種菌的抑制效果均明顯高于0.05 mg/L的臭氧水溶液對3 株菌的抑制效果，臨床上為達到良好的治療效果，應使用濃度≥0.1 mg/L的臭氧水溶液，且作用時間以達到60 s為宜。但實際應用中，還可能存在不少缺陷。因此，需要進一步深入研究。