根管濕潤度對根管封閉性的影響

陳永菊 李新 潘亞萍 鄭丹 商曄 王鵬林

根管治療術(root canal therapy，RCT)是一種使用特定的器械與儀器清理根管并達到一定形態，藥物沖洗根管進行化學消毒，牙膠等充填材料嚴密填充根管最后進行冠方修復的治療方法。根管治療能有效地控制感染，是目前牙髓治療預防根尖周病和促進根尖病愈合最為有效的治療手段。根管治療的目的是完完全全地將整個根管系統的空間封閉，預防組織液、細菌等根管外的影響治療的因素進入根管，影響治療效果[1]。有研究表明[2]治療過程中如果存在不完善的地方會促進微滲漏的形成，微滲漏作為治療失敗的主要原因，在失敗原因中所占比重大約為60%。根尖微滲漏(Apical microleakage， AM)是微生物及其產物、血液等外界因素在通過牙膠等材料與根管壁、牙膠自身等彼此之間的細微縫隙[3]，造成失敗的根管治療。根管微滲漏是一個復雜的問題，可被多種因素影響，例如根管濕潤情況、根充技術、根管封閉劑的物理化學性能等，且不同的根管沖洗方案均將影響根管封閉性能[4-5]。根管濕潤度對整個根管系統的封閉性是最基礎的[6]，水量的多少或者是否存在水分將阻礙、減緩或加速促進根充糊劑的凝固過程，降低根管封閉性[7]。到目前為止，微滲漏的研究方法很多，如染料滲入法、液體濾過法、電化學法、放射性同位素滲透法、細菌(內毒素)滲漏法和葡萄糖定量法，目前最簡單、最直接和最常用的方法便是染料滲入法[8]，染料滲入法是通過測量染料滲入根管的線性距離來反映微滲漏的大小。根管水分測量儀是一種可對根管內濕潤度進行精準測量的儀器，然后通過精準的測量數據建立根管不同濕潤度的體外模型，通過一系列相關微滲漏檢測試驗獲得最佳根管濕潤度。

本實驗通過染色滲透實驗和細菌微滲漏實驗對根管內不同濕潤度對根管充填治療的影響進行研究，以期獲得最佳根管濕潤度并能為根管水分測量儀的臨床應用提供試驗理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 試劑與菌株 5.25% 次氯酸鈉溶液、 0.9% 氯化鈉溶液(遼寧民康制藥有限公司)； AH-Plus糊劑、 氧化鋅糊劑、 17% EDTA、 牙膠尖、 吸潮紙尖(Densply, 美國)；印度墨水(北京諾博萊德科技有限公司)；濃硝酸溶液、 無水乙醇溶液(沈陽一化)；冬青油(深圳國鑫香精香料有限公司)；指甲油(上海卓多姿中信化妝品)； 鏈霉素(沈陽美羅制藥)；胰蛋白胨、 大豆蛋白胨、 瓊脂粉(Sigma，美國)；硅橡膠印膜材(登士柏，瑞士)。

糞腸球菌標準株：Enterococcus faecalis ATCC19433(中國普通微生物菌種保藏管理中心， 隸屬中國科學院微生物研究所)。

1.1.2 儀器 根管水分測量儀(遼寧錦州錦研科技有限公司研發, 圖 1); 高速手機、 低速手機(SINOL西諾，德國); K 銼、 GG鉆(登士柏， 美國)； 垂直加壓器(上海康橋)； 熱牙膠充填儀(Bee Fill Pack， VDW， 德國)； 體視顯微鏡(南京舜宇光學儀器有限公司)； 37 ℃ 恒溫CO2培養箱(Thermo Scientific, 美國)； EP管、 凍存管(海門市海克拉斯實驗器材有限公司)； 超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)； 微量加樣器(Thermo公司， 芬蘭)； 恒溫鼓風干燥箱(上海醫療器械七廠)； 電子天平(沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司)； 分光光度儀(上海元析儀器有限公司)； 10 ml玻璃瓶(沈陽一化玻商貿有限公司)。

圖 1 根管水分測量儀Fig 1 Root canal moisture meter

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌培養與樣品處理 糞腸球菌孵育于由15 mg/ml 胰蛋白胨、 5 mg/ml大豆胨、 15 mg/ml瓊脂和5 mg/ml Nacl配比成的胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSAuditor，TSA)， pH值為7.2， 在37 ℃， 5% CO2條件下細菌培養箱中培養。依據菌落形態和革蘭氏染色初步證實為糞腸球菌純培養。挑取單個的糞腸球菌菌落接種至未加入瓊脂的TSA液體培養基。使用分光光度儀調整細菌在600 nm處的吸光度值達為0.6備用。

1.2.2 樣品采集與處理 收集來錦州醫科大學附屬第二醫院和錦州市口腔診所拔除的單根管牙齒160 顆，要求牙根發育完好、沒有根尖孔損壞、牙根面沒有裂痕、沒有根面齲、牙根沒有內外吸收。5.25% 次氯酸鈉浸泡1 h，去除牙石及牙周膜，浸泡在0.9%生理鹽水放置在4 ℃保存備用。高速手機截冠，常規開髓、拔髓，GG鉆擴根管口，建立直線通道， 10#K 銼插入根管，根尖孔可看到銼尖為止，工作長度為測量長度減1 mm，手用不銹鋼器械應用逐步后退法預備根管，17% EDTA去除根管內的玷污層，每次更換器械均使用3 ml 5.25%次氯酸鈉液沖洗根管，最后用3 ml蒸餾水沖洗根管1 min。

1.2.3 濕度設定及實驗分組 觀察本院醫生根管充填前干燥根管的過程與步驟，并做好相關記錄。在室溫下，離體牙體外模擬臨床操作過程。并將160 個離體牙根隨機分為實驗一、二兩組各80 顆牙齒，按照臨床醫生操作，應用根管水分測量儀測定不同干燥方式的濕潤程度，記錄數據值。

首先將各實驗組牙齒根據干燥后測量數值將濕潤度分為4 組，儀器的基礎值0.250～0.260 V，每組20 個樣本。

①濕潤度1 組：干燥后含水量值在0.250～0.299 V范圍； ②濕潤度2 組：干燥后含水量值在0.300～0.599 V范圍； ③濕潤度3組：干燥后含水量值在0.600～0.899 V范圍； ④濕潤度4組：干燥后含水量值在0.900～1.199 V范圍。根據充填條件不同，每個濕潤組內再分為2 個方式組，每組10 個樣本。 氧化鋅糊劑組：聯合熱牙膠垂直加壓充填技術； AH-Plus糊劑組：聯合熱牙膠垂直加壓充填技術。

1.2.4 根管充填 體外熱牙膠垂直加壓充填技術的操作步驟：①選取手用垂直加壓器3 個，直徑由小到大，最小的距離根尖3～4 mm處觸碰根管壁； ②試定主牙膠尖； ③調拌適量的根充糊劑并涂布于根管內，將蘸有糊劑的主尖插入根管內； ④攜熱器先去除根管口外的牙膠，再軟化根管上端的牙膠，選用最粗的垂直加壓器對牙膠加壓； ⑤將攜熱器插入到牙根中部的牙膠中3 s， 迅速取出并用中號垂直加壓器加壓； ⑥如⑤一樣垂直充填根尖部； ⑦Bee Fill Pack加熱牙膠注射充填，并垂直壓緊牙膠，完成充填，拍攝X線片檢驗充填效果。

1.2.5 實驗一：染色滲透實驗

1.2.5.1 牙齒染色處理 將實驗一組內充填好的離體牙標本放置在37 ℃、 100% 濕度的孵育箱中7 d，確保充填使用的根充糊劑完全凝固。除了根管口及根尖孔2 mm以外，實驗組的所有牙根外表面均勻地涂上兩層指甲油。待指甲油干燥凝固后，將充填好的離體牙試件用線懸掛裝有1.5 mm印度墨水的EP管內，將根尖區域沉浸在印度墨水中7 d。

1.2.5.2 牙齒透明化處理 所有牙齒從印度墨水中取出，流動自來水下將染料沖洗干凈，手動將指甲油去除。將全部牙齒放入裝有10% 硝酸溶液的24 孔板內浸泡5 d， 每24 h更換1 次硝酸溶液。通過小型號針能毫無阻力地刺穿牙齒最后的地方來判斷牙齒是否已經完全脫礦。脫礦的牙齒被流動自來水沖洗，然后置于蒸餾水中，每小時更換一次蒸餾水。然后將脫礦牙齒放在呈梯度上升的乙醇中進行脫水，操作如下： 80% 乙醇中脫水過夜， 90% 和100% 乙醇中各脫水2 h。隨后將牙齒取出，待在空氣中干燥后，將所有牙齒放入到水楊酸甲酯(冬青油)中2 h，完成最后的透明過程(圖 2)。

1.2.5.3 染色滲透長度測量 透明化處理后的牙齒，染色滲透長度在體視顯微鏡下觀察并測量，每個樣本測量3 次，長度精確到0.01 mm。本實驗中采用了標本透明法，可在不損害標本的前提下重復并定量測量染料滲透的長度。

1.2.6 實驗二：細菌微滲漏實驗

1.2.6.1 細菌微滲漏模型制備 選取另外一組根管充填及濕潤度分組后的80牙齒，將牙根涂兩層指甲油，細菌滲漏模型由兩個腔室組成，制作方法如下：將每個細胞凍存管的末端用刀片整齊的切掉，將離體牙根端置于切口處，用硅橡膠將牙根固定在切口處，外表面涂上兩層502膠水，凍存管內牙根根管口以上空間構成了模型的上室；將連結好的上室結構連接到玻璃瓶內，銜接處依然用硅橡膠固定口，并涂上兩側502膠水，玻璃瓶與凍存管之間的空間構成了模型的下室。滅菌后，下室內裝有5 ml未加入瓊脂的無菌的TSA液態培養基，確保牙根至少有3 mm進入到液態培養基中；上室裝有3 ml無菌培養基，以監測滲漏模型(圖 3)。

圖 2 染色滲漏模型Fig 2 Dye leakage model

A: 細菌微滲漏模型; B: 下室出現渾濁圖 3 細菌培養及微滲漏模型建立A: Bacterial microleakage model; B: Turbidity in the lower chamberFig 3 Bacterial culture and microleakage model establishment

1.2.6.2 細菌微滲漏天數檢測 將A600=0.6的糞腸球菌的細菌懸濁液置于上室內，每周取出上室內部分培養基更換為新鮮培養基2 次，確保上室內含有活性菌。將所有模型置于37 ℃恒溫箱中，每天觀察下室的渾濁度，持續100 d， 記錄每個泄漏樣品的出現濁度的天數。在制備最終裝置前按照以上步驟預實驗，檢測裝置連接處用以上方法的密合性。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 應用氧化鋅與AH-Plus根充糊劑行熱牙膠垂直充填后的X線片

A: 氧化鋅糊劑組; B: AH-Plus組圖 4 不同根充糊劑充填后X線片觀察A: Zinc oxide paste group； B: AH-Plus groupFig 4 Filling results of different root filling paste observed by X-ray film

結果示,應用氧化鋅及AH-Plus 2 種不同的根充糊劑充填根管后其X線片結果無顯著差異。

2.2 不同糊劑充填方式下，不同濕潤度組滲透結果的比較(圖 5)

熱牙膠配合氧化鋅糊劑充填方法中，濕潤度1組的染料滲入長度平均為(1.56±0.64) mm，濕潤度4組的染料滲入長度平均為(3.60±0.74) mm(P<0.05)； 應用AH-Plus糊劑充填方法中，濕潤度1組的染料滲入長度平均為(1.02±0.08) mm，濕潤度4 組的染料滲入長度平均為(2.57±0.70) mm(P<0.05)；AH-Plus糊劑組的長度均值小于氧化鋅糊劑組，但在相同充填方式下，隨著根管內濕潤程度的增加，染料滲入的長度也隨之增加(圖 6)。

2.3 不同糊劑充填方式下，不同濕潤度對細菌微滲漏的影響

由表 1可知，不同充填方式下，不同的濕潤度組之間，隨著濕潤度的增加糞腸球菌滲漏到模型下室的天數在逐漸縮短。其中氧化鋅糊劑充填組內, 整體分布的Log-rank檢驗的χ2為9.571，P=0.023<0.05,每組間函數分布不同；AH-Plus糊劑充填組內,整體分布的Log-rank檢驗的χ2為8.516，P=0.036<0.05,函數整體分布情況不同，且該組濕潤度3 組與4 組中還存在100 d觀察期結束后，仍然未發生細菌滲漏(圖 7)。由此可知，根管內的濕潤程度對根管的密封性是有影響的，隨著濕潤程度的增加，密封程度相對減弱。

圖 5 體視顯微鏡下觀測染色滲漏情況(×15)Fig 5 Stain leakage observed under stereomicroscopic(×15)

3 討 論

根管充填是根管治療中極為關鍵的一部分，根尖區的緊密充填能有效的防止根尖周的微生物和冠方組織液二次進入根管，如此降低了細菌及其產物再次定植于根管的機率，盡可能的減少微滲漏的發生，降低根管治療失敗率[9]。根管系統多存在根管側枝管間交通等細微結構，且結構復雜多變，增加了根管治療的難度。這些結構在治療過程中分支細微、不規則，在治療過程中預備、沖洗、充填時容易被遺漏，從而成為細菌的棲息地。此外即使根管完整的充填治療了，菌群也會通過微間隙滲漏到細微根管結構與充填材料之間，使得根尖病變經久不愈導致失敗的根管治療。所以根管系統尤其是根尖區的三維充填對于成功治療根尖病等非常重要。有大量的研究表明[10]根充糊劑用于填補存在于牙膠與根管壁和牙膠與牙膠的空隙，與牙膠彼此互補配合，保證并增加了密封效果，明顯降低微滲漏預防根管再感染。

圖 6 不同濕潤度組微滲漏長度的比較(①： 與濕潤度1組比較， P<0.05; ②： 與濕潤度2組比較， P<0.05； ③： 與濕潤度3組比較， P<0.05；④：與濕潤度4組比較， P <0.05)Fig 6 Comparison of microleakage lengths in different wettability(①: vs. group 1, P<0.05; ②: vs. group 2, P<0.05; ③: vs. group 3, P<0.05; ④: vs. group 4， P<0.05)

表 1 不同濕潤度對細菌微滲漏天數的比較Tab 1 Comparision of bacteria microleakage under different wetting degree n=10)

根管濕潤會對糊劑凝固時間產生一定影響，還可能會對其與牙膠、牙本質的界面有影響，使界面處存在縫隙發生微滲漏。研究表明[11]根管內的濕潤度不同會對糊劑的封閉有影響，因此根管濕潤度的情況是根管充填前非常重要步驟。有研究者道，在封閉性能上，根充糊劑樹脂類的要比氫氧化鈣類、氧化鋅丁香油類的更加優越[12]，但少數研究認為無論何種材料的糊劑封閉效果沒有明顯差異[13]。本實驗結果顯示:采用糊劑AH-plus的比氧化鋅的滲漏長度略短，但在相同的充填方法與糊劑的條件下，隨著濕潤性的增加，滲漏長度也逐漸增加。說明無論氧化鋅糊劑還是AH-Plus糊劑的充填材料都是在濕潤度最小的組內發生滲漏的程度最小，因此2 種不同糊劑應用說明根管內濕潤程度對根充的封閉性是有影響。

圖 7 不同濕潤度組微滲漏對糞腸球菌生存影響(AH-Plus糊劑組生存函數上的“+”表示100 d觀察期結束后，仍然未發生細菌滲漏的模型)Fig 7 Effect of microleakage on the survival of enterococcus faecalis in different moisture degree(Note: The “+” on the survival function of the AH-Plus paste group indicates that there is still no model of bacterial leakage after the end of the 100 d observation period)

本研究的第二個試驗方法采用的細菌微滲漏法，使用細菌滲漏的模型的評價方式更接近于臨床實際情況，選用的細菌為糞腸球菌(E.faecalis)，把糞腸球菌當做滲漏發生的示蹤劑來進行研究。選用此菌的原因如下：①E.faecalis是常駐腸道、口腔等地方的兼性厭氧、革蘭陽性的正常寄居菌群。②研究顯示，E.faecalis不會或者幾乎非常少量的存在于沒有治療過的根管內，然而根管治療后根管被污染二次發生感染的根管，檢驗出來的細菌之中，E.faecalis是主要細菌，檢出率從22%～77%的都有而且可以達到初次感染根管的9 倍[14]。本研究通過建立細菌微滲漏模型，結果顯示，隨著濕潤度的增加糞腸球菌滲漏到模型下室的天數的均值與中位天數在逐漸縮短。而且隨著濕潤度的不同，累計函數的分布也不同，且具有統計學差異。

此外，本研究的優勢主要在于應用根管水分測量儀(錦州錦研科技有限公司研發)清晰明了的劃分根管的濕潤度，目前國內外還沒有可以測量根管內濕度的口腔儀器。牙根管水分測量儀目前處于初期研究和探索階段，其關鍵技術主要包含兩大部分：第一，信號轉換器探測水分含量。為了達到探測水分含量的目的，信號轉換器中包含有驅動電路、發射電路、接收電路、運算放大電路、輸出電路等； 工作時，發射電路發射一定頻率的電磁波，電磁波穿過挫夾、探針、患者口腔和唇鉤組成的回路后，電磁波信號由接收電路接收； 通過運算放大電路比較發射和接收的電磁波強度，我們就能得出水含量的大小。第二，信號的采集與處理。在信號轉換器探測出水含量的基礎上，我們采用了基于ARM Cortex-M內核的單片機處理系統來采集和處理信號轉換器輸出的水含量信號。通過染色滲透實驗和細菌微滲漏實驗來進行微滲漏研究； 此檢測方法有以下優點：操作相對簡單易控、耗費相對低廉、有較好的實用性和有效性及良好的臨床相關性。采用糞腸球菌作為本實驗細菌模型所選擇的的細菌[15]，把糞腸球菌作為示蹤劑來進行滲漏研究，基本設計類似于目前國際上大多數實驗模型。

實驗的結果顯示根管內的濕潤程度對根管的密封性是有影響的，隨著濕潤程度的增加，密封程度相對減弱。本實驗通過應用根管水分測量儀定性測量根管壁的濕潤程度，從而獲得充填最佳的封閉效果，為根管水分測量儀的臨床應用提供實驗依據。但本實驗采用染料滲入及細菌微滲漏法還有一定的局限性：染料滲入法試驗中，無論將牙體縱劈、橫切還是透明化處理，均不能反應示蹤物滲入的體積，因此不能反映微滲量；細菌微滲漏模型同樣只能定性得出根管封閉效果。因此對根管水分測量儀的臨床應用探究還需進一步做出更為深入的實驗，從量上證明根管水分測量儀的臨床實用性；其次根管水分測量儀自身也在探索中，以后期為定量測量根管濕潤度做出進一步的改進。