口腔癌患者循環外泌體促進舌癌細胞CAL27增殖、遷移、侵襲中的作用

郭怡 彭紅 蹇淑娟 陳慧 代喆穎 江玲 李秀臣 崔曉燕

外泌體是由細胞分泌的直徑在30～100 nm范圍的，表面具有特定分子標記如CD9和CD63的磷脂雙分子膜性囊泡[1]。這些囊泡幾乎存在于人體所有的體液中，包括血液、血漿/血清、唾液、乳汁、腦脊液、尿液、精液等[2]。外泌體中含有多種物質，如蛋白質、DNA、mRNA、miRNA、LncRNA等[3-4]。這些生物學分子可經外泌體轉運到不同細胞中，并對細胞中信號通路和蛋白表達進行調控，從而影響受體細胞的生物學行為[5-7]。最新研究表明，腫瘤來源的外泌體參與到腫瘤細胞與基底細胞的遺傳信息的交換，促進了腫瘤的生長、侵襲與轉移，并且外泌體在腫瘤耐藥中發揮重要作用[8-10]。口腔癌患者外周血中外泌體的水平較正常人明顯增高，可能與口腔癌的發展和轉移有密切關系[11]。本研究擬在此基礎上，探討口腔癌患者外周血中外泌體在口腔癌發展、侵襲中作用，為口腔癌防治提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

DMEM-高糖培養基、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、雙抗(青霉素+鏈霉素)、胰蛋白酶(Hyclone公司， 美國)；基質膠(BD公司， 美國)； RIPA裂解液(9806S)(武漢飛羿科技有限公司)； 蛋白上樣緩沖液、兔抗人β-actin一抗、羊抗兔二抗、羊抗兔熒光二抗、BCA蛋白定量檢測試劑盒、 SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、Western blot電泳液、轉膜液、DAPI顯影劑、定影劑(武漢谷歌生物科技有限公司)； ECL化學發光試劑盒(Thermo Fisher公司， 美國)； 兔抗人CD9、CD63、Ki67一抗(Sigma公司， 美國)； 細胞培養耗材(江蘇NEST耐思生物科技有限公司)； Transwell小室(Corning公司， 美國)； Avanti J-26XP離心機(Beckman Coulter公司， 美國)； H-7000FA透射電鏡(Hitachi公司， 日本)； 蛋白凝膠成像系統(ChemiScope 4300 Pro型， 上海Clinx公司)。

1.2 循環外泌體分離純化與鑒定

1.2.1 循環外泌體分離純化 本研究選取2012-01-01～2016-12-31就診于武漢市第三醫院(武漢大學附屬同仁醫院)口腔科的口腔鱗狀細胞癌患者20例。所有患者均經局部組織切取活檢術確診為口腔鱗狀細胞癌。本研究符合倫理要求，患者及家屬均知情同意。收集每例口腔癌患者外周血5 ml，按下列方法1 次離心： ① 1 500 g離心20 min，收集上清；② 16 500 g離心20 min，再次收集上清；③ 0.2 μm濾器過濾，收集過濾液；④ 120 000 g離心70 min，棄上清，PBS重懸沉淀；⑤ 120 000 g離心70 min，棄上清，以150 μl PBS重懸沉淀，以BCA法測定外泌體蛋白濃度，凍存于-80 ℃備用。

1.2.2 循環外泌體鑒定 分別用透射電鏡技術(TEM)、蛋白電泳技術(Western blot)檢測離心所得的沉淀，分析沉淀物質的顆粒大小及外泌體標志物的表達。

1.3 細胞培養

人舌癌細胞系(CAL27)購自中國典型培養物保藏中心(武漢)。CAL27細胞培養用含10%FBS的DMEM高糖培養基培養于37 °C，約95%濕度和5% CO2濃度的恒溫培養箱，隔天換液，每3 d傳代1 次。

1.4 Western blot

以RIPA 裂解液裂解細胞/外泌體后超聲震蕩 3 次(每次 5～10 s)， 12 000 r/min速度離心15 min， 取上清并用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度。按所測蛋白濃度計算樣品(蛋白上樣量為20 μg)和上樣緩沖液體積后，將其混合并置于 95 °C 水浴鍋中水浴 5 min。配制10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，80 V恒壓下蛋白電泳至分離膠與濃縮膠界面時換為 120 V 電壓， 然后 200 mA， 2 h 恒流下將蛋白轉至 PVDF 膜。封閉 2 h 后，分別以CD9(1∶500)、CD63(1∶1 000)、 p-Rb(1∶1 000)、cyclin D1(1∶1 000)、β-actin(1∶10 000)抗體 4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜 3次，每次 10 min。相應二抗室溫孵育2 h，TBST 洗膜 3 次，每次10 min。化學發光劑顯色后，蛋白凝膠成像系統分析樣品中目標蛋白的相對含量。

1.5 透射電鏡觀察

將PBS重懸的外泌體樣品吸附至鎳網上，自然風干； 2.5%的戊二醛固定10 min，PBS漂洗3 次；加入CD63抗體20 μl(1∶100)于37 ℃孵育2 h，PBS漂洗3 次，加入金標二抗20 μl(1∶100)于37 ℃孵育1 h，PBS漂洗3 次；醋酸鈾負染5 min，以濾紙吸干染液；待樣品干燥后置于透射電鏡下觀察。

1.6 細胞劃痕試驗

將對數生長期的CAL27細胞以5×105/孔接種于6 孔板中，培養24 h后，用20 μl無菌吸頭沿培養孔的正中劃一道劃痕，PBS輕輕沖洗去除游離細胞，對照組加入正常培養基，實驗組另加入終濃度為40 μg/ml循環外泌體。

1.7 Transwell實驗

將鋪有基質膠的Transwell小室置于24 孔板上，在外室加入500 μl含有40 μg/ml外泌體的完全培養基，小室內加入300 μl無血清培養基垂懸的CAL27細胞懸液(1×106/ml)。培養24 h后，從培養箱中取出Transwell小室，PBS清洗，用棉簽擦去上層基質膠和細胞，95%乙醇固定10 min，結晶紫染色10 min，PBS沖洗3 次，顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 裸鼠移植瘤實驗

將對數生長期的CAL27以PBS重懸，使細胞密度為1×107個/ml。 將200 μl含有CAL27細胞的PBS懸液注射于裸鼠腹側皮下。待腫瘤長至150 mm3后，隨機分為對照組(n=20)和外泌體處理組(n=20)，外泌組每隔2 d經尾靜脈給予每只裸鼠50 μl循環外泌體(1 mg/ml)，PBS組則給予50 μl PBS。外泌體一共注射了5 次，觀察期的起點是第一次注射外泌體。每隔2 d觀察并測量和記錄腫瘤大小，連續觀察和測量4 周。腫瘤體積計算公式為：(長×寬×寬)/2。觀察期結束后，處死裸鼠，取下腫瘤標本及肺組織，制成石蠟切片進行后續實驗。

1.9 免疫熒光實驗

切片脫蠟、梯度酒精入水后，滴加適量ki67一抗，37 ℃孵育1 h；PBS洗去抗體；滴加適量對應二抗， 37 ℃避光孵育30 min，PBS洗去抗體；以含DAPI封片劑封片；最后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.10 統計學分析

2 結 果

2.1 口腔癌患者循環外泌體的鑒定

以圖 1A所示的程序收集口腔癌患者循環外泌體。透射電鏡下，分離所得的沉淀呈雙層膜結構，大小范圍為20～100 nm，其中50～60 nm的雙層膜結構最多(圖 1B)。Western blot結果提示，離心分離的沉淀中高表達CD63(圖 1C)。免疫電鏡結果提示，CD63、CD9表達的位置位于雙側膜結構外膜(圖 1D)。表明本研究分離所得的沉淀為外泌體。

A： 循環外泌體分離步驟; B: 透射電鏡下循環外泌體的形態; C： Western blot法檢測循環外泌體中CD9和CD63的表達; D： 免疫電鏡法檢測循環外泌體中CD9和CD63的表達(箭頭： 納米金顆粒)

圖 1 口腔癌患者循環外泌體的分離與鑒定

A: Separation procedure of circulating exosomes; B: TEM imag of circulating exosomes; C: The expression of CD9 and CD63 determined with western blot; D: The expression of CD9 and CD63 detected by immune electron microscopy (The white arrows indicate gold nanoparticles)

Fig 1 Isolation and identification of circulating exosomes from oral cancer patients

2.2 口腔癌患者循環外泌體促進口腔癌細胞增殖

將分離純化的循環外泌體(0～60 mg/L)加入到CAL27細胞中培養72 h，MTT檢測循環外泌體對CAL27增殖狀態的影響。結果提示，口腔癌患者循環外泌體顯著刺激CAL27細胞增殖，且促進增殖的效應與外泌體的濃度有關，即0～40 mg/L時，濃度越高，促增殖效果越強；當大于40 mg/L時，促增殖效應達到平臺期(圖 2A)。我們進一步檢測與細胞周期密切相關的蛋白cylinD1和phospho-Rb在CAL27細胞中的表達，結果提示循環外泌體可上調cylinD1和phospho-Rb的表達(圖2B)。

A： 增殖曲線; B： p-Rb和cylin D1的表達圖 2 口腔癌患者循環外泌體對CAL27增殖活性的影響A: Growth curves; B: Expression p-Rb and cylin D1Fig 2 Proliferation of CAL27 cells after incubation with circulating exosomes

2.3 口腔癌患者循環外泌體促進口腔癌細胞遷移和侵襲

本研究采用經典的細胞劃痕試驗來檢測口腔癌患者循環外泌體對CAL27細胞遷移能力的影響(圖 3A)。細胞劃痕試驗結果表明：循環外泌體處理組CAL27劃痕傷口在24 h基本愈合，而此時對照組劃痕傷口尚未愈合，差異有統計學意義(P<0.05)。采用Transwell小室法檢測循環外泌體對CAL27細胞侵襲能力的影響(圖 3B)，12 h和24 h對照組和循環外泌體組穿過基膜的細胞數之間的差異具有統計學意義(P<0.05)。

A： CAL27細胞遷移; B： CAL27細胞侵襲圖 3 口腔癌患者循環外泌體對CAL27細胞遷移和侵襲能力的影響A: The migration of CAL27 cells; B: The invasion of CAL27 cellsFig 3 The effects of circulating exosomes from oral cancer patients on CAL27 cell migration and invasion

2.4 裸鼠體內環境下口腔癌患者循環外泌體對口腔癌的促進增殖的作用

選擇裸鼠動物模型為體內實驗模型進行研究。連續觀察4 周時，外泌體處理組腫瘤體積明顯大于對照組，差異具有統計學意義(P<0.01)；腫瘤生長曲線結果提示，外泌組腫瘤生長速度明顯快于對照組(圖 4A、 4B)，差異具有統計學意義(均P<0.05)。將老鼠處死后收獲腫瘤組織，并稱重，隨后固定制成組織切片。外泌體組腫瘤腫瘤組織重量與對照組相比明顯增加(圖 4C)，差異具有統計學意義(P<0.01)。以免疫熒光法檢測腫瘤標本中Ki67的表達情況，結果提示外泌體組腫瘤組織中Ki67的表達水平明顯高于PBS組(圖 4D)。結果表明：口腔癌患者循環外泌體在體內具有促進口腔癌生長的作用。

3 討 論

細胞源性囊泡根據其大小不同，可分為微粒(microparticles, MPs,直徑100～1 000 nm)、外泌體(直徑小于100 nm)和凋亡小體(apoptotic bodies,直徑大于1 000 nm)三類[12]。外泌體是細胞膜先向內出芽形成胞內多囊泡體，然后多囊泡體再向外與細胞膜融合并釋放出的膜性囊泡[13]。與另外2 種囊泡外泌體和凋亡小體相比，外泌體具有獨特的生物學特征和功能，并且能從母細胞繼承特異性生物信息分子,包括膜抗原、蛋白質[3]。當外泌體在1980 年首次被發現后，其被認為是細胞排泄廢物的一種方式，如今隨著大量對其生物來源、其物質構成及運輸、細胞間信號的傳導以及在體液中的分布的研究發現，外泌體具有多種多樣的功能[14]。外泌體的功能取決于其所來源的細胞類型，其可參與到機體免疫應答、抗原提呈、細胞遷移、細胞分化、腫瘤侵襲等方方面面。有研究表明，腫瘤來源的外泌體參與到腫瘤細胞與基底細胞的遺傳信息的交換，從而導致大量新生血管的生成，促進了腫瘤的生長與侵襲[15-16]。

全球每年約有40～50 萬口腔癌的新發病例，治療方法為以手術為主、 結合放療和化療的綜合治療。口腔癌的5 年生存率僅為50%～60%，每年造成約20 萬人死亡[17-19]。此外，近年來口腔的發病年齡趨于年輕化[20-21]。因此，研究口腔癌的發生、發展，以期尋求更好的治療方法有重要的臨床意義。最新的研究雖然已經發現口腔癌患者循環外泌體含量較正常人明顯增高，可能參與口腔癌的發生和發展，并且可以將循環外泌體作為口腔癌患者的生物標志物(biomarker)[2]。但循環外泌體究竟在口腔癌的發生、發展中起什么樣的作用，目前仍然不清楚。

A: 1～4 周腫瘤生長情況; B: 1～4 周腫瘤生長曲線； C：對照組和外泌體處理組腫瘤重量; D: 免疫熒光法檢測對照組和外泌體處理組腫瘤組織中Ki67的表達水平
圖 4 口腔癌患者循環外泌體在裸鼠體內促進CAL27細胞增殖
A:Invivoxenograft tumors after the indicated treatment for 1-4 weeks; B: Growth curves of the xenograft tumors after the indicated treatment; C: Weights of the harvested xenograft tumors; D: The expression of Ki-67 in the xenograft tumor tissues determined by immunofluorescence histochemistry analysis
Fig 4 The effects of circulating exosomes from oral cancer patients on CAL27 cell proliferation in nude mice

本研究通過收集口腔癌患者循環外泌體，并將外泌體作用于口腔癌細胞，觀察外泌體對口腔癌細胞的增殖、遷移與侵襲的作用。結果表明，口腔癌患者循環外泌體在體外可顯著促進口腔癌細胞的增殖、遷移和侵襲。裸鼠移植瘤試驗結果與體外試驗結果一致，即口腔癌患者循環外泌體可促進口腔癌細胞的增殖。

綜上所述，口腔癌患者循環外泌體可促進口腔癌細胞的增殖、遷移、遷移，本研究的結果可為口腔癌的治療開辟新的思路。