影響脂肪組織工程中細胞外基質支架的相關因素研究進展

曹婷　劉毅

[摘要]支架作為組織工程三要素之一，它主要是作為細胞臨時附著點，其降解速度應與組織再生速度相匹配，待組織重建后支架可降解排泄，不對人體造成任何損害。目前研究的組織工程支架主要有天然可降解高分子材料、人工合成的可降解高分子材料、無機材料等，脂肪組織脫細胞基質支架作為近年來的研究熱門，因其來源豐富、取材方便，受到研究者們的青睞，本文就影響脂肪組織細胞外基質支架的相關因素綜述如下。

[關鍵詞]脂肪組織細胞外基質；脫細胞組織基質；生物支架 ；脂肪組織；可降解性；活性物質

[中圖分類號]Q954.65+5 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2019）01-0160-04

Factors Affecting Adipose Tissue Extracellular Matrix Scaffold

CAO Ting，LIU Yi

（Department of Burn and Plastic Surgery ，the 940th of Joint Logistics Support Force of Chinese Peoples Liberation Army， Lanzhou 730050， Gansu，China ）

Abstract： As one of the three elements of tissue engineering， scaffold is mainly used as a temporary attachment point of cells. Its degradation rate should match the rate of tissue regeneration. After the tissue is reconstructed， the scaffold can be degraded and excreted without causing any damage to the human body. Currently， the tissue engineering scaffolds studied mainly include natural degradable polymer materials， synthetic degradable polymer materials， inorganic materials， etc. In recent years. adipose tissue decellularized matrix scaffolds have been studied popularly due to the advantages of its sources and convenience in materials. This article will review the correlative factors affecting the extracellular matrix scaffold of adipose tissue.

Key words： adipose tissue extracellular matrix； acellulartissue matrix； biological scaffold； adipose tissue； degradability； active substance

脫細胞組織基質 （Acellular Tissue Matrix， ACTM）是近年來軟組織缺損修復領域的研究熱點，通過使用物理、化學、生物的方法對組織進行脫細胞處理， 去除移植物的相關抗原，最大程度地保留細胞外的活性物質及超微結構，獲得的生物衍生材料。目前已研發的ACTM包括脫細胞真皮基質、小腸黏膜下基質、心包、心瓣膜、小口徑動脈，泌尿系統的膀胱、輸尿管及尿道等。脂肪組織由于來源豐富，易于獲取，臨床應用中不存在倫理學問題，安全性能高，許多研究指出細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）可被完全降解，大約95%的降解產物通過尿液排出，幾乎無降解物被宿主吸收。脂肪組織脫細胞基質不僅可作為組織工程的支架，亦可作為獨立的軟組織缺損填充物，有著巨大的應用潛能。本文主要闡述影響脂肪組織細胞外基質支架的相關因素。

1 脫細胞方法

脫細胞的目標是既要清除干凈組織中的細胞成分，徹底消滅組織的抗原性，又要最大程度地保留細胞外基質的3D超微結構、生物活性及組織的完整性。目前脫細胞方法主要有：物理機械法、化學法、生物法。Brown[1]等通過三種不同的脫細胞方法，表明不同脫細胞化方法制備的脫細胞脂肪組織細胞外基質（decellularized adipose tissue extraeellular matrix，DAM）在結構和生物、化學性能上的不同，因此，強調了脂肪組織脫細胞化方案的重要性。

1.1 物理機械法：主要有凍融法（快速冷凍組織后，細胞內冰晶形成，破壞細胞膜，導致細胞溶解，主要通過反復凍融以提高脫細胞的作用）、離心振蕩法[2]（將黏附在組織上的血液等液體成分徹底洗滌干凈后，低速離心后高速勻漿、離心、凍干等程序后，可得到脂肪組織ECM成分）和壓力法[3]，壓力法是在一定溫度下，將組織完全浸泡于磷酸鹽緩沖液中，其中含有一定量的葡聚糖，對其進行緩慢加壓，使細胞完整性遭到破壞，造成細胞溶解。壓力法對 ECM 非緊密排列的組織或器官效果已得到肯定。

1.2 化學法：去細胞常用的化學方法包括低滲/高滲溶液、離子型/非離子型去污劑、酸/堿處理、螯合劑及有機溶劑萃取。酸和堿可以使細胞質成分有效溶解并破壞核酸，但同時也能破壞其他物質，如細胞外基質中的重要成分糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG）。非離子洗滌劑如曲拉通（Triton）X-100）是脫細胞過程中研究及應用較多的，且常與其它洗滌劑配合使用[4]，如和十二烷基硫酸鈉（So-dium dodecyl sulfate，SDS）相配合，便可以起到比較好的脫細胞效果[5-6]。高、低滲液是通過滲透壓的變化使組織中細胞溶解。螯合劑，如常用的如乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）和乙二醇雙四乙酸（ethylene glycol bis（2aminoethyl ether）tet—raacetic acid，EGTA）。細胞與ECM黏附中會出現二價的陽離子，螯合劑可在作用過程中形成印戒狀分子復合物，該復合物與二價陽離子相結合，促使細胞與ECM分離。螯合劑在脫細胞過程中的作用主要是輔助金屬離子破壞蛋白與蛋白間的聯系。EDTA常常和胰蛋白酶聯合使用[7]，但單獨使用螯合劑不能去除組織表面的細胞，因此，常與酶類或除垢劑相聯合，以達到較好的脫細胞效果。眾多研究者將生物、物理、化學三種方法與螯合劑聯合起來作用于成塊脂肪組織，使從中提取的脫細胞脂肪基質能夠基本保持其原有的特異性，同時具有誘導 ADSCs 成脂分化的能力[8-9]。

特別是SDS已被證明可以與ECM形成強烈的相互作用，能夠改變基質結構。在研究開始后，無論是SDS和脫氧膽酸鈉造成不可逆的降解和形成的腫脹結構呈凝膠狀物質。另外，SDS難以在處理結束后除去，并能顯著地影響細胞活力。也有實驗直接使用交聯劑EX-810與蒸餾水和超聲相配合對組織進行脫細胞處理并取得成功[10]，說明交聯劑也具有脫細胞的作用。由于化學脫細胞處理法時間相對較長，不可避免地會有微生物污染，因此，許多去細胞處理方案中也加入青霉素、鏈霉素等抗生素，或者也可采用電子束照射、γ射線等方法對所得組織進行滅菌處理[11]。

1.3 生物法：主要為酶處理法。包括胰蛋白酶、脂肪酶、中性蛋白酶、核酸酶等。胰蛋白酶是脫細胞中常用的蛋白水解酶之一。一方面是因為它能夠破壞組織的亞顯微結構，可促進隨后脫細胞試劑對組織的滲透，因此，常作為脫細胞程序中的第一步。另外，它是一種特異度比較高的蛋白水解酶，能特異性切斷賴氨酸和精氨酸C端的多肽鍵（鄰位不是脯氨酸情況下）。其最適溫度為37℃，而對于相同的試劑，作用的時間、順序和方法不同也會造成不同的結果。脫細胞方案中極小的差別也會大大影響脫細胞效果及所得組織性狀，最適pH為8.0。雖然目前胰酶在脫細胞方案中經常用到，但它的脫細胞效果一般，特別對較厚的組織，胰酶無法完全清除組織深部的細胞成分[12-14]。胰蛋白酶對組織也有副作用，對ECM會有不同程度的破壞，其程度與作用時間成正比[15]。胰酶不會影響組織中的膠原含量。相關研究證明彈性組織與胰蛋白酶/EDTA的作用時間越長，彈性蛋白和糖胺聚糖含量就會大量減少，甚至會將組織的抗張強度減少50%[16]。因此，要減少胰蛋白酶對ECM的副作用，就要盡量縮短胰蛋白酶的作用時間。核酶主要作用是引起DNA/RNA的降解，磷酸酯酶A2主要作用為水解細胞的磷脂成分。

此外，相同的脫細胞方案對不同的組織效果不盡相同，脂肪脫細胞基質的制備方法完全決定了所得到的組織細胞外基質天然結構及功能的保留程度，在脫細胞程度最大化前提下，最大可能的保存細胞外基質的生理結構和生物活性，是制備脫細胞生物材料的最終目標。

Flynn[17]結合物理、化學、生物等脫細胞方法。首先將樣品在冷凍緩沖溶液進行凍融三個周期（-80℃～37℃），接著用胰蛋白酶消化溶解并用99.9%異丙醇進行極性溶劑提取，去除脂質含量后繼續在酶溶液中消化兩次。后用DNaseII型（從牛胰臟提取）及RNaseⅢ型A（來自牛胰臟）和VI-S型脂肪酶處理后，再次在99.9%的異丙醇的極性溶劑中提取。得到的組織結構幾乎是保存完好的。Masson染色證實了脫細胞的有效性，LN和CIV電鏡下可見整體ECM的超微結構在經過加工后是保存完整的。即使高倍率下，微小的纖維化膠原蛋白結構完整，這表明此脫細胞方案對細胞外基質造成的損傷很小。接種ASC并培養24h后行組織學分析表明ASC分布良好，廣泛附著并分布在支架上。Suto[18-21]等研究發現在軟骨、骨等組織工程中采用反復凍融技術可有效脫細胞，且對細胞外基質的結構和性能無顯著影響，且與凍融循環次數無明顯關聯。范雪嬌[22]等人考慮到化學試劑及生物酶處理時間較長，可能影響材料的性能，將Flynn法中的凍融次數由3次增至5次；將胰蛋白酶作用的22h及異丙醇的56h分別縮短至12h和44h，將對組織的總處理時間由5d縮短至4d；并將除凍融外的余作用過程均采用低速震蕩，以促進脫細胞液與組織充分作用。經各項檢測并證實此改良方法可行。宋玫[23]將脂肪組織反復凍融5次，異丙醇提取12h，胰蛋白酶、DNase-I，RNase-A處理4h后所得到的組織經檢測及種植于大鼠皮下均獲得成功。田亞菲[24]等將脂肪組織脫細胞后與人脂肪干細胞黏附、培養，并于大鼠體內移植證實了得到的人ACAM具有良好的組織相容性和可降解性，適于細胞增殖及分化；聯合人ADSCs在小鼠體內能夠成功生成成熟的脂肪組織，可作為一種理想的組織工程支架。

2 影響脂肪組織細胞外基質支架的因素

2.1 脫細胞藥物對DAM的影響：Brown等[1]研究表明每次脫細胞方法產生的脂肪ECM支架結構和生物學特性等不同，強調用于產生脂肪ECM支架的去細胞化方案的重要性。Lumpkins等[25-26]報道稱異丙醇脫脂效果雖好，但它會與膠原蛋白及黏多糖發生交聯反應，使材料表面特性改變；胰蛋白酶具有一定脫細胞效果，但也會一定程度的破壞細胞外基質中的膠原蛋白和彈性蛋白，影響材料黏彈性[26-27]。Crapo等[27-28]證實材料微結構改變會影響種子細胞的黏附、增殖等細胞相容性，并且此副反應與作用時間成正相關性。

2.2 支架對細胞的影響：脂肪組織支架可影響種子細胞的黏附及生長發育，而不同的材料成分和納米結構對干細胞的增殖、分化產生的影響也不同。Wu等[29]將脫細胞所得的脂肪基質生物支架與脂肪干細胞復合后證實該支架可以支持干細胞的增殖并且具有促使其向脂肪細胞分化的作用。將此基質植入大鼠皮下，發生較輕微的炎癥反應，且移植后的區域生成的脂肪組織同時血管化，周圍細胞長入基質中。相關研究證實支架硬度除了影響細胞形態、細胞行為，也影響細胞基因的表達[30-31]。支架微形態也影響著細胞的形態和功能。Kulangara等[32]制備3D支架并將人骨髓間充質干細胞種植于支架進行培養，發現細胞的遷移速度明顯較 2D平面的細胞快。Oh等[33]使用離心分離法制備梯度孔徑的支架材料，與不同類型細胞進行培養，觀察到不同的支架孔徑中生長了不同的細胞，如軟骨細胞和成骨細胞主要分布于380～405μm，成纖維細胞主要分布于186～200μm孔徑，骨細胞主要分布于290～310μm孔徑。真空冷凍干燥技術可用于三維多孔生物支架成型，目前主要用于聚合物乳液、多聚糖、水凝膠等材料的支架成型，它以可生物降解的聚合物溶液為對象，以純水凍結后的冰晶為孔隙源，凍干后的支架孔隙率為91%～95%、孔徑范圍為20μm～200m，且內部連通性好[34]。

2.3 交聯劑對DAM的影響：交聯劑可抑制炎性細胞的浸潤，可能因為經交聯劑處理的組織，其基質蛋白之間形成了阻礙炎性細胞浸潤的障礙，并且經交聯的基質蛋白，可耐受蛋白酶的降解[35]。交聯劑在脫細胞過程中，會改變支架的機械性能。因此交聯劑處理的支架，不但抵抗了脫細胞過程的破壞，也能脫細胞和封閉抗原。直接使用交聯劑EX-810配合蒸餾水和物理超聲脫細胞成功[10]，不但說明交聯劑也是一種脫細胞試劑，也證實了交聯基質會增加組織對酶降解的抗性，也就是交聯劑可以在一定程度上延長人脂肪組織脫細胞基質在體內的停留時間。Brown[37]等研究表明，相同材料，脫細胞徹底的支架較大量細胞存在的支架相比較，新生組織瘢痕前者較后者明顯減輕。

3 DAM對組織血管再生的影響

組織工程的最終目標是實現功能性再生受損或缺失的組織。巨噬細胞在組織移植中具有重要作用，在植入生物支架的新血管形成方面，巨噬細胞通過分泌血管生成因子，在序貫激活M1和M2表型巨噬細胞過程中起關鍵作用。特別是已經證明M1巨噬細胞可以引發血管發芽而M2巨噬細胞亞型刺激周圍細胞募集，吻合口和血管重塑[38]。巨噬細胞的轉化在血管再生中發揮著非常重要的作用。M1、M2巨噬細胞除促進血管形成外，分泌的促血管生成因子如VEGF、PDGF、TGF-β和bFGF等還可刺激間質干細胞向成纖維細胞、成肌纖維細胞等轉化，成纖維細胞、成肌纖維細胞可在缺損處形成肉芽組織促進傷口愈合[39]。Badylak及其同事證明了脫細胞生物支架可誘導巨噬細胞極化朝著更具建設性的表型，這種轉變是于組織方面更有利的結果轉變[40-41]。

另外，脂肪細胞外基質材料具有極好的可塑性，可制成片狀、管狀、粉末狀等形態，并可通過控制凍存的溫度來調節基質材料孔徑的大小[42-43]。

4 結語

脂肪組織細胞外基質支架展示了它在組織工程方面巨大的應用潛力。目前，安全無毒、徹底的、可最大程度地保留細胞外活性物質及三維結構的脫細胞方法成為研究熱門及難點，作為組織工程細胞支架的生物材料 ，一般必須具有良好的生物相容性、生物可降解性、細胞相容性、一定的力學性能、可加工性及可滅菌性[44]。隨著生活水平的提高，抽脂術及腹壁整形等手術的盛行，廢棄的脂肪組織等所制備的自體組織生物支架在仿生結構、可塑性、免疫原性等方面都大大優于非自體組織來源的生物材料。而目前已成功商品化的脫細胞真皮基質，成功應用于臨床的小腸黏膜下基質、心血管系統的心包、心瓣膜、泌尿系統的膀胱、輸尿管、尿道等，預示著DAM成功應用于臨床指日可待。

[參考文獻]

[1]Brown BN，Freund JM，Han L，et al.Comparison of three methods for the derivation of a biologic scaffold composed of adipose tissue extracellular matrix[J].Tissue Eng Part C Methods，2011，17（4）：411-421.

[2]察鵬飛，高建華，陳陽，等.人脂肪組織細胞外基質支架的構建[J].中華整形外科雜志， 2012，28（1）：55-60.

[3]Negishi J，Funamoto S，Kimura T，et al.Porcine radial artery decellularization by high hydrostatic pressure[J].Tissue Eng Regen Med，2015，9（11）：E144-E151.

[4]Wang P，Li C，Zhang R，et al.Various methods of preparing acellular tissue-engineered xenogeneic valve stents[J].Crter，2009，13（16）：3041-3044.

[5]Sabetkish S， Kajbafzadeh AM， Sabetkish N， et al. Whole-organ tissue engineering： decellularization and recellularization of three-dimensional matrix liver scaffolds[J].J Biomed Mater Res（Part A），2015，103（4）：1498-1508.

[6]Elder BD，Eleswarapu SV，Athanasiou KA.Extraction techniques for the decellularization of tissue engineered articular cartilage constructs[J]. Biomaterials，2009，30（22）：3749-3756.

[7]孫亨，王艷霞，吳江.組織脫細胞方法的研究進展[J].四川解剖學雜志，2011， 19（4）：24-30.

[8]Turner AEB，Yu C，Bianco J，et al.The performance of decellularized adipose tissue microcarriers as an inductive substrate for human adipose-derived stem cells[J]. Biomaterials，2012，33（18）：4490-4499.

[9]Yu C，Bianco J，Brown C，et al.Porous decellularized adipose tissue foams for soft tissue regeneration[J].Biomaterials，2013，34（13）：3290-3302.

[10]武欣，谷涌泉，段紅永，等.利用脫細胞血管基質體外構建小口徑組織工程血管[J].中國實驗動物學報，2010，18（5）：377-382.

[11]陸軍，肖學鈞，陳欣欣.比較牛頸靜脈去細胞處理實驗方法[J].嶺

南心血管病雜志，2008，14（6）：440-443.

[12]崔小平，張永紅，薛軍.胰蛋白酶法和 Triton X-100 法脫豬軟骨細胞的比較[J].中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（46）：23.

[13]韓嘯，蔣雄剛，徐鵬，等.聚乙二醇和胰蛋白酶用于豬動脈管道去細胞效果比較[J].華中科技大學學報：醫學版，2007，36（4）：551-553.

[14]Wang P，Li C，Zhang R，et al.Various methods of preparing acellular tissue-engineered xenogeneic valve stents[J].Crter，2009，13（16）：3041-3044.

[15]Gilbert TW，Sellaro TL，Badylak SF.Decellularization of tissues and organs[J]. Biomaterials，2006，27（19）：3675-3683.

[16]Freytes DO，Stoner RM， Badylak SF. Uniaxial and biaxial properties of terminally sterilized porcine urinary bladder matrix scaffolds[J].J Biomed Mater Res（Part B）， 2008，84（2）：408-414.

[17]Flynn LE.The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells[J].Biomaterials，2010，31（17）：4715-4724.

[18]Suto K，Urabe K，Naruse K，et al. Repeated freeze–thaw cycles reduce the survival rate of osteocytes in bone-tendon constructs without affecting the mechanical properties of tendons[J].Cell Tissue Bank，2012，13（1）：71-80.

[19]Jung HJ，Vangipuram G，Fisher MB，et al.The effects of multiple freeze–thaw cycles on the biomechanical properties of the human bone‐patellar tendon‐bone allograft[J].J Orthop Res，2011，29（8）：1193-1198.

[20]Allen KD， Athanasiou KA. A surface–regional and freeze–thaw characterization of the porcine temporomandibular joint disc[J].Ann Biomed Eng，2005， 33（7）： 951-962.

[21]Lu H，Hoshiba T，Kawazoe N，et al.Comparison of decellularization techniques for preparation of extracellular matrix scaffolds derived from three‐dimensional cell culture[J].J Biomed Mater Res A，2012，100（9）：2507-2516.

[22]范雪嬌，田春祥，傅月荷，等.脂肪脫細胞基質的制備和初步評價[J].中國修復重建外科雜志，2014，28（3）：377-383.

[23]宋玫，劉毅，惠玲.利用脂肪脫細胞基質構建組織工程化脂肪的實驗研究[J].解放軍醫藥雜志，2016，28（1）：30-34.

[24]田亞菲.人脂肪組織細胞外基質支架的制備與檢測及其在大鼠軟組織缺損模型中降解的實驗研究[D]. 蘭州：蘭州大學，2016.

[25]Lumpkins SB，Pierre N，McFetridge PS.A mechanical evaluation of three decellularization methods in the design of a xenogeneic scaffold for tissue engineering the temporomandibular joint disc[J].Acta Biomater，2008，4（4）： 808-816.

[26]Crapo PM，Gilbert TW，Badylak SF.An overview of tissue and whole organ decellularization processes[J].Biomaterials，2011，32（12）：

3233-3243.

[27]Lovekamp JJ，Simionescu DT，Mercuri JJ，et al.Stability and function of glycosaminoglycans in porcine bioprosthetic heart valves[J].Biomaterials，2006， 27（8）：1507-1518.