三草素抗炎作用的機制研究

李麗珍，陳嘉炫

（1.福建醫(yī)科大學附屬龍巖市第一醫(yī)院，福建 龍巖 364000；2.福建中醫(yī)藥大學附屬龍巖人民醫(yī)院，福建 龍巖 364000）

感染性疾病是臨床的常見病和多發(fā)病。隨著抗生素新品種的日益增加，臨床應用越來越廣泛，其濫用和不合理用藥現(xiàn)象時常發(fā)生，造成嚴重的不良反應和耐藥菌株的產(chǎn)生，給臨床治療帶來困難，也給患者增加經(jīng)濟負擔。世界衛(wèi)生組織（WHO）的專家指出：“抗生素的耐藥問題成為一個全球性的公共健康問題，最令人擔心的是多重耐藥性的上升，減少抗生素的不合理應用是控制抗生素耐藥性的最重要的措施之一”［1］。此外，從傳統(tǒng)中草藥中尋找抗炎、抗菌的中草藥制成安全有效的制劑也是今后的研究方向。三草素是筋骨草、魚腥草、草珊瑚的黃酮類化合物。根據(jù)筋骨草、魚腥草、草珊瑚民間和傳統(tǒng)應用經(jīng)驗，結(jié)合現(xiàn)代對其有效成分、藥理作用的研究成果，本研究通過三草素含藥血清對經(jīng)脂多糖（lipopolys-accharide，LPS）誘導 RAW264.7 巨噬細胞的影響，初步研究三草素抗炎作用的機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康清潔級SD種大鼠50只，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號（2007000536576）。實驗和飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±1）℃，濕度40%～70%。明暗各12 h，早上9點投食，定期紫外線消毒，每日更換飲水及飼料，保持動物生活環(huán)境通風及清潔衛(wèi)生。

1.2 實驗細胞株 RAW264.7小鼠單核巨噬細胞白血病細胞購自武漢博士德生物工程有限公司，貨號：CX0260。

1.3 實驗藥物 三草素（福建中醫(yī)藥大學藥用植物資源科研室提供）；醋酸潑尼松（浙江仙琚制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號：120336）。

1.4 實驗試劑 戊巴比妥鈉（中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司，批號：F20020405）；胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、DMEM高糖培養(yǎng)基、1%青鏈霉素合劑、0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、脂多糖（美國Sigma公司）；75%乙醇消毒液（江西健寶醫(yī)藥科技有限公司，批號：20120216）；LTB4 試劑盒（上海聯(lián)碩生物科技有限公司）；IL-1β、IL-6、TNF-α試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.5 實驗儀器 TGL-16G型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠制造）；Bio-Rad Mode lm680酶標儀（美國Gene公司）；H-1600RW臺式高速離心機（德國Hettich公司）；潔凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；超低溫冰箱、恒溫水浴鍋、CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）。

2 方 法

2.1 三草素含藥血清的制備 將清潔級SD大鼠隨機分為空白組，陽性組，三草素低、中、高劑量組。陽性組按0.015 g／（kg·d）予醋酸潑尼松藥液灌胃，三草素高、中、低劑量組分別按 6、3、1.5 g／（kg·d）予三草素藥液灌胃，空白組予等量飲用水灌胃。每日灌胃2次，連續(xù)干預3 d，末次給藥2 h后腹主動脈取血，3 000 r／min 離心 20 min，取上層血清，56 ℃滅活30 min，0.22 μm濾膜過濾除菌，分裝后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細胞培養(yǎng) 用0.25%的胰蛋白酶消化處于生長對數(shù)期的單層培養(yǎng)細胞，終止消化，1 000 r／min離心5 min，棄上清液后加入完全培養(yǎng)基（90%DMEM高糖培養(yǎng)基，10%FBS、1%雙抗）制成細胞懸液，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度為105個／mL，接種于96孔板上，每孔加200 μL細胞懸液。將96孔板放入培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2、飽和濕度）中培養(yǎng) 24 h。

2.3 含藥血清對RAW264.7細胞增殖的影響 分組：空白對照組、空白血清組、陽性血清組、低劑量三草素血清組、中劑量三草素血清組、高劑量三草素血清組。空白對照組加入完全培養(yǎng)基，余下各組加入含10%相應大鼠血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入10 μL 0.5 mg／mL的MTT液及90 μL無血清DMEM培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，棄上清液，加入 100 μL DMSO，搖勻。使用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測定各孔吸光度A值，記錄結(jié)果。

2.4 含藥血清對LPS誘導的RAW264.7細胞增殖的影響 分組：空白對照組、空白血清組、模型組、陽性血清組、低劑量三草素血清組、中劑量三草素血清組、高劑量三草素血清組。空白對照組加入完全培養(yǎng)基，模型組加入含10%空白血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，余下各組加入含10%相應大鼠血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h后，除空白對照組和空白血清組外，其他各組加入終濃度為100 ng／mL的LPS進行誘導，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h。應用MTT法檢測各組各孔吸光度A值，記錄結(jié)果。按照公式計算細胞相對抑制率［2］。

細胞相對抑制率／%＝（1－含藥血清組A值均值／模型組A值均值）×100%

2.5 含藥血清對LTB4的生成及炎癥細胞因子的影響 分組：空白血清組、模型組、陽性血清組、低劑量三草素血清組、中劑量三草素血清組、高劑量三草素血清組。空白對照組加入完全培養(yǎng)基，模型組加入含10%空白血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，余下各組加入含10%相應大鼠血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h后，除空白血清組外，其他各組加入終濃度為100 ng／mL的LPS進行誘導，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h。干預后將96孔板予3 000 r／min離心5 min，收集上清液。根據(jù)試劑盒操作程序檢測上清液中LTB4、IL-1β、IL-6、TNF-α 濃度。

2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料符合正態(tài)分布以（）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。

3 結(jié) 果

3.1 三草素含藥血清對RAW264.7細胞增殖的影響 說明各給藥劑量組具有促進RAW264.7細胞增殖的活性，無細胞毒性，對RAW264.7細胞的生存沒有影響。結(jié)果見表1。

表1 三草素含藥血清對RAW264.7細胞增殖的影響（）

表1 三草素含藥血清對RAW264.7細胞增殖的影響（）

注：與空白對照組比較，1）P＜0.05。

組別空白對照組空白血清組陽性血清組低劑量三草素血清組中劑量三草素血清組高劑量三草素血清組n 6 6 6 6 6 6 A值0.261±0.015 0.416±0.0471）0.465±0.0351）0.456±0.0801）0.470±0.0731）0.435±0.0441）

3.2 含藥血清對LPS誘導的RAW264.7細胞增殖的影響 RAW264.7細胞經(jīng)LPS誘導后，促進細胞生長活性，細胞增殖迅速。高、中、低劑量血清組和陽性血清組具有抑制經(jīng)LPS刺激的RAW264.7細胞的生長活性，抑制RAW264.7細胞的增殖。結(jié)果見表2。

表2 三草素含藥血清對LPS誘導的RAW264.7細胞增殖的影響（）

表2 三草素含藥血清對LPS誘導的RAW264.7細胞增殖的影響（）

注：與空白對照組比較，1）P＜0.05；與空白血清組比較，2）P＜0.05；與模型組比較，3） P＜0.05。

組別空白對照組空白血清組模型組陽性血清組低劑量三草素血清組中劑量三草素血清組高劑量三草素血清組n 6 6 6 6 6 6 6 A值 相對抑制率／%0.323±0.019 0.416±0.0471）0.815±0.0972）0.580±0.0703）0.613±0.0703）0.649±0.0633）0.640±0.0453）— —28.8 24.7 20.4 21.5

3.3 含藥血清對 IL-1β、IL-6、TNF-α 細胞因子及LTB4的影響 見表3。

表3 含藥血清對對IL-1β、IL-6、TNF-α 細胞因子及LTB4的影響（）

表3 含藥血清對對IL-1β、IL-6、TNF-α 細胞因子及LTB4的影響（）

注：與空白血清組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別空白血清組模型組陽性血清組低劑量三草素血清組中劑量三草素血清組高劑量三草素血清組n 6 6 6 6 6 6 IL-1β／（pg／mL）26.96±11.77 103.57±12.671）66.65±28.342）62.21±31.242）65.73±32.822）70.42±20.562）IL-6／（pg／mL）67.90±29.78 621.7±138.71）86.24±28.562）85.76±36.032）82.19±31.722）93.86±53.802）TNF-α／（pg／mL）1268.95±136.12 2951.40±582.91）1196.14±65.772）1388.68±231.42）1338.68±191.22）1607.10±350.82）LTB4／（ng／L）197.44±44.75 258.20±5.351）233.26±18.782）240.84±25.98 244.47±21.71 223.99±27.992）

4 討 論

巨噬細胞可以通過激活機體的免疫系統(tǒng)，釋放脂類介質(zhì)、細胞因子和活性氧等一系列炎癥介質(zhì)，參與機體的炎癥級聯(lián)反應［3］。研究顯示，RAW264.7小鼠單核巨噬細胞可參與機體的免疫過程，特別是機體受到LPS等外界刺激后能夠促進體內(nèi)炎癥介質(zhì)的生成，并且啟動機體抵抗炎癥系統(tǒng)的功能［4］。因此，本研究采用LPS刺激RAW264.7小鼠單核巨噬細胞建立研究炎癥細胞模型。

LTB4可激活中性白細胞的多種反應，包括加速炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，促進中性白細胞在微血管內(nèi)皮粘著，接著滲出血管，其他趨化因子使炎癥反應擴大，LTB4在依賴中性白細胞的炎癥反應中發(fā)揮著一種內(nèi)在放大器的作用［5］。細胞因子有很多種類，其中IL-1β、IL-6和TNF-α細胞因子等顯得較為重要。IL-1β主要是由活化的單核-巨噬細胞產(chǎn)生，可以活化T細胞、促進B細胞的增殖分化。IL-6可以提高內(nèi)皮細胞的通透性，促進中性粒細胞和內(nèi)皮細胞間的黏附，可以促進T、B細胞的增殖分化，在B細胞的分化過程中發(fā)揮著重要作用。TNF-α是機體的炎癥反應與免疫應答的重要調(diào)節(jié)因子，在內(nèi)毒素病毒及其他細胞因子刺激下由不同細胞分泌，主要來自單核-巨噬細胞和T淋巴細胞，是強有力的促炎癥反應的細胞因子［5］。中草藥的抗炎功效一般與抑制炎性細胞因子的產(chǎn)生有關(guān)，中草藥通過其他途徑發(fā)揮抗炎功效的同時，還會影響細胞因子，從而發(fā)揮共同的抗炎作用［6］。

本研究結(jié)果顯示，三草素含藥血清高劑量血清組降低LPS誘導的RAW264.7細胞LTB4的生成；不同劑量三草素含藥血清均可不同程度地降低LPS誘導的 RAW264.7細胞 IL-1β、IL-6和 TNF-α細胞因子的分泌，初步表明三草素可能是通過降低上述炎癥介質(zhì)的分泌而發(fā)揮抗炎作用的。