HPLC法同時(shí)測(cè)定白芍中5種成分含量

張嘉嘉，馬 遲，朱志靈，張松柏，張 勛

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

白芍為毛莨科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽(yáng)的功效［1］，主要分布于安徽、浙江、四川等地［2］。其主要有效成分為芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷以及沒(méi)食子酸等［3］，具有保肝、抗炎、抗風(fēng)濕、免疫調(diào)節(jié)功能等藥理作用［4］。芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷是白芍眾多成分中公認(rèn)的藥效物質(zhì)，以前者含量最高；芍藥內(nèi)酯苷為芍藥苷的同分異構(gòu)體，在補(bǔ)血、抗抑郁、糖尿病潛在治療方面具有優(yōu)于芍藥苷的藥效特點(diǎn)［5］；沒(méi)食子酸具有抗炎的作用［6］。2015版《中華人民共和國(guó)藥典》僅以芍藥苷作為含量測(cè)定的指標(biāo)性成分，成分單一，專屬性不強(qiáng)，不足以反映白芍的總體質(zhì)量。錢珺等［7］采用HPLC法同時(shí)測(cè)定白芍顆粒中的5種成分，以乙腈與0.1%磷酸為流動(dòng)相，但考慮到該流動(dòng)相體系對(duì)色譜柱和儀器損傷較大，希望可以探索出更好的流動(dòng)相體系。因此本文收集了20批白芍飲片及藥材，采用HPLC法對(duì)其所含的沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-五沒(méi)食子酰葡萄糖5種成分進(jìn)行測(cè)定，以期為提高白芍質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 AR224CN型電子分析天平（常州奧豪斯儀器有限公司）；EX225DZH型電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；KQ-500DE型醫(yī)院數(shù)控超聲清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；安捷倫1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 白芍對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品質(zhì)量檢定研究院，批號(hào)：120905-201109）；沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：B20851、YY90574、YY90477、B21148）；β-五沒(méi)食子酰葡萄糖（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：P816672）；甲醇、甲酸、乙腈均為色譜純（默克化工技術(shù)有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水皆為實(shí)驗(yàn)室蒸餾水。20批白芍樣品信息見表 1（其中1～19號(hào)均經(jīng)過(guò)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院黃澤豪老師鑒定，均為白芍飲片；20號(hào)為白芍對(duì)照藥材）。

表1 20批白芍樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 Welch Ultimate?XB-C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相乙腈（A）-0.05%甲酸（B）。 梯度洗脫：0～10 min，5%～10%A；10～30 min，10%～15%A；30～45 min，15%～30%A。 流速1 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng) 230 nm；柱溫 30℃；進(jìn)樣量5 μL。各峰的分離度均大于1.5。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-五沒(méi)食子酰葡萄糖適量，加甲醇超聲溶解后分別制成346.8、319.6、222.0、366.8、353.6 μg／mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。 分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋得每1 mL含 86.7、79.9、55.5、91.7 和 88.4 μg 上述 5 種成分的混合對(duì)照品溶液，保存于4℃冰箱中備用。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末過(guò)80目篩，精密稱取0.25 g，置25 mL具塞三角燒瓶中，精密加入75%甲醇后超聲處理（功率240 W，溫度60℃）30 min，放冷，補(bǔ)足失重。過(guò)0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液于20 mL量瓶中，依次對(duì)半稀釋得5組不同濃度的對(duì)照品混合液，編號(hào) 1～6。按“2.1”項(xiàng)測(cè)定。以對(duì)照品的濃度（μg／mL）為橫坐標(biāo)（X），峰面積（mAU）為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 5種成分的線性回歸方程

2.4.2 精密度 取對(duì)照品稀釋混合液 5 μL，按“2.1”項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定。一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-五沒(méi)食子酰葡萄糖峰面積的RSD分別為0.36%、1.73%、0.39%、3.0%、1.59%，5種成分峰面積的RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性 取1份批號(hào)為Bs2015121506的樣品制備供試品溶液，分別于第0、12、24、36和48 h按“2.1”項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-五沒(méi)食子酰葡萄糖峰面積的RSD 分別為 2.98%、2.68%、2.37%、1.73%、2.41%，表明白芍供試品溶液中各成分在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性 取批號(hào)為Bs2015121506的樣品6份，按“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)測(cè)定。 結(jié)果沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-五沒(méi)食子酰葡萄糖峰面積的RSD分別為2.76%、2.78%、2.05%、1.37%、1.93%，5種成分峰面積的RSD均小于3%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率 取批號(hào)為Bs2015121506的樣品、精密稱取6份，分別加入樣品含量50%的對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，“2.1”項(xiàng)測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算平均加樣回收率。結(jié)果沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-五沒(méi)食子酰葡萄糖的平均加樣回收率分別為100.37%、99.03%、101.22%、100.94%、101.79%，RSD 分 別為2.34%、2.53%、2.78%、1.21%、2.65%。

2.5 樣品測(cè)定 2.3項(xiàng)下處理20批樣品，“2.1”項(xiàng)下進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-五沒(méi)食子酰葡萄糖的含量，結(jié)果見表3。

3 討 論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 混合對(duì)照品稀釋液在190～400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)檢測(cè)，分別在250 nm和230 nm附近出現(xiàn)兩個(gè)吸收峰，且在230 nm下各目標(biāo)成分峰形、分離度較好，檢出強(qiáng)度適中，故選擇230 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇 15版藥典以乙腈與0.1%磷酸為流動(dòng)相，但對(duì)色譜柱和儀器損傷較大，本實(shí)驗(yàn)考察不同濃度的甲酸對(duì)芍藥苷拖尾因子的影響，可以改善芍藥苷峰形。

3.3 提取溶劑的選擇 考察不同濃度的甲醇、乙醇對(duì)目標(biāo)成分提取效率的影響，結(jié)果選擇75%甲醇作為提取溶劑時(shí)提取效率最高。

3.4 提取方法的選擇 在提取方法的選擇上采用高效液相色譜為檢測(cè)手段，以提取效率為考察參數(shù)，將回流提取法和超聲提取法進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，在提取時(shí)間、提取試劑用量等方面，超聲提取更有優(yōu)勢(shì)，提取時(shí)間短、提取效率高，是中藥材有效成分提取的一種新興方法。

綜上所述，本研究建立HPLC法，同時(shí)測(cè)定白芍中沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β-五沒(méi)食子酰葡萄糖5種成分的含量，可以為白芍整體質(zhì)量控制評(píng)價(jià)體系的建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

表3 20批白芍樣品5種成分含量%

序號(hào)1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20樣品批號(hào)Bs2015121401 Bs2015121402 Bs2015121403 Bs2015121404 Bs2015121405 Bs2015121406 Bs2015121407 Bs2015121408 Bs2015121409 Bs2015121410 Bs2015121501 Bs2015121502 Bs2015121503 Bs2015121504 Bs2015121505 Bs2015121506 Bs2015121507 Bs2015121508 Bs2015121509 Bs2015121510沒(méi)食子酸含量0.084 0.102 0.117 0.097 0.087 0.152 0.080 0.156 0.090 0.083 0.101 0.096 0.084 0.098 0.096 0.093 0.125 0.129 0.111 0.137氧化芍藥苷含量0.016 0.022 0.000 0.025 0.016 0.000 0.010 0.000 0.025 0.023 0.020 0.022 0.016 0.019 0.027 0.026 0.017 0.018 0.021 0.023芍藥內(nèi)酯苷含量0.454 0.534 0.462 0.566 0.726 0.943 0.753 0.947 0.517 0.449 0.539 0.526 0.454 0.406 0.563 0.940 0.454 0.454 0.446 0.537芍藥苷含量0.260 2.380 0.260 2.470 1.430 0.090 2.290 0.190 2.240 2.430 2.090 2.170 2.120 2.870 2.870 2.830 2.590 2.620 2.770 2.880 β-五沒(méi)食子酰葡糖含量0.223 0.286 0.306 0.319 0.238 0.381 0.292 0.330 0.240 0.292 0.239 0.276 0.223 0.201 0.250 0.308 0.316 0.422 0.253 0.409