二氫楊梅素對活化的BV2小膠質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)化的影響

胡永紅，魏藝聰，管江麗，余 意，桂孟玹，王瑞國

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

神經(jīng)炎癥由激活和增殖的小膠質(zhì)細胞及星形膠質(zhì)細胞等引發(fā)，生成促炎細胞因子、趨化因子等炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷［1-2］。小膠質(zhì)細胞（mi croglia，MG）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的組織駐留巨噬細胞，在神經(jīng)發(fā)育、體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)炎癥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［3］。活化后的小膠質(zhì)細胞根據(jù)表型不同，可分為M1型（促炎型）及M2 型（抗炎型）小膠質(zhì)細胞［4］。 二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）具有加速抗氧化、止咳、抗腫瘤，保肝等多種藥理作用［5-6］，由于毒性小，近年來抗炎作用也備受關(guān)注。因此本研究用體外炎癥模型來探討DMY對BV2細胞表型變化的影響，旨在進一步確認(rèn)DMY作為新型神經(jīng)保護劑的可能性及其潛在的神經(jīng)保護機制，為后續(xù)疾病的研究和新藥的開發(fā)提供實驗參考。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 BV2細胞株通過上海復(fù)祥生物科技有限公司采購于美國ATCC公司。

1.2 實驗藥物與試劑 二氫楊梅素（源葉生物公司，批號：S06J6L1，純度＞98%）；脂多糖（LPS，美國Sigma公司，批號：L2880）；RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（美國 Gibco公司）；CD14抗體（美國CST公司）；iNOS抗體（美國 Santa cruz公司），Arg1抗體（美國abcam公司）。

1.3 實驗儀器 倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；Primor高速臺式冷凍離心機（美國 Thermo Fisher公司）；酶標(biāo)儀（TECAN 公司）；MiNiPROTEANTetra小型垂直電泳槽、MiNiTrans-Blot小型轉(zhuǎn)印槽、ChemiDocXRS、凝膠成像分析系統(tǒng)（美國 Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) BV2細胞用完全培養(yǎng)基（含10%FBS、100 U／mL 青霉素、10 μg／mL 鏈霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)基）進行培養(yǎng)，將其置于 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，每隔24 h換1次培養(yǎng)液，48 h傳代1次。

2.2 DMY對細胞活性的影響 將DMY溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，配制成 100 mmol／L 的儲存液，－4℃儲存。取對數(shù)生長期BV2細胞按1×104／孔的密度接種于96孔板中，使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，在含1%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中分別加 入 0、10、20、40、50、60、80、100 μmol／L DMY 以替換舊培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL的MTT（5 mg／mL），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，每孔加入 150 μL DMSO，震蕩10 min至甲臜顆粒完全溶解，酶標(biāo)儀490 nm波長處測定各孔OD值，并計算出各組細胞活力。

細胞活力／%＝實驗組吸光值／對照組吸光值×100%。

2.3 細胞分組及干預(yù) 實驗分為5組，即正常組、LPS 組 （100 ng／mL）、DMY 低 劑 量 組 （10 μmol／L DMY＋100 ng／mL LPS）、DMY 中劑量組（20 μmol／L DMY＋100 ng／mL LPS）、DMY 高劑量組（40 μmol／L DMY＋100 ng／mL LPS）。 BV2細胞用 DMY 干預(yù)半小時后，給予LPS進行造模，培養(yǎng)24 h后去掉上清液，收集細胞進行后續(xù)實驗。

2.4 Western Blot檢測 取對數(shù)生長期的BV2細胞，按照 3×105／孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，按上述分組進行干預(yù)造模，培養(yǎng)24 h后，去掉上清液保留細胞沉淀，提取總蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒說明測定各組蛋白濃度后，加入蛋白上樣緩沖液并調(diào)整上樣量后，進行SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜并封閉，按照不同分子量將 NC 膜分別加入稀釋的 iNOS（1∶200）、CD14（1∶1 000）、Arg1（1∶1 000）抗體中，4 ℃搖床過夜。 孵育結(jié)束，TBST洗膜3次，每次10 min。洗膜結(jié)束后用二抗（1∶10 000）室溫孵育 2 h，TBST 洗膜 3 次，每次10 min。使用 ECL化學(xué)發(fā)光顯影定影。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理均用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用（）表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗方法（Nonparmetric tests）。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊則采用LSD檢驗，方差不齊則用Games-Howell檢驗。

3 結(jié) 果

3.1 DMY對BV2細胞活力的影響 DMY濃度為60～100 μmol／L 時，DMY 明顯降低 BV2 細胞活性（P＜0.01），見圖 1。

圖1 不同濃度DMY作用后BV2細胞活力的變化

3.2 DMY對BV2細胞蛋白表達的影響 見圖2～3。

圖2 5組BV2細胞CD14、iNOS、Arg1蛋白電泳圖

圖3 DMY對CD14、iNOS、Arg1蛋白表達影響

4 討 論

小膠質(zhì)細胞在神經(jīng)炎癥、神經(jīng)修復(fù)和神經(jīng)毒性中起著關(guān)鍵作用［7］。當(dāng)小膠質(zhì)細胞被炎癥介質(zhì)刺激激活時，它們可以通過吞噬作用或分泌各種炎癥介質(zhì)來修復(fù)神經(jīng)元損傷；然而，當(dāng)小膠質(zhì)細胞不斷被激活時，這些炎癥介質(zhì)可能是有害的［8］。可溶性脂多糖受體CD14是一種糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，是Toll樣受體的輔受體，CD14激活后，Toll樣受體可與病原體表面的特異性抗原結(jié)合，進一步激活核因子，引起炎癥反應(yīng)，在細菌、病毒、真菌等感染過程中具有重要作用［9］。本研究中二氫楊梅素能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞中CD14的表達，表明CD14在炎癥發(fā)生過程中起著重要的作用，且DMY具有抑制小膠質(zhì)細胞激活的作用。

有研究認(rèn)為，M1小膠質(zhì)細胞的過度活化和M2小膠質(zhì)細胞缺乏響應(yīng)是神經(jīng)炎癥發(fā)生的重要機制，可通過誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞從促炎性的M1型向抗炎性M2型的轉(zhuǎn)化，以達到緩解CNS炎癥，減輕神經(jīng)元損傷的目的，是神經(jīng)保護治療的一種有效方法，但是目前關(guān)于小膠質(zhì)細胞表型的研究相對較少［10-11］。本研究中，小膠質(zhì)細胞活化后，經(jīng)DMY干預(yù)治療后，iNOS表達明顯降低，而Arg1表達明顯增加，且均具有劑量相關(guān)性，表明DMY可抑制活化小膠質(zhì)細胞向M1型即促炎表型極化，并促進其向M2型即抗炎表型轉(zhuǎn)化，以達到抑制神經(jīng)炎癥、保護神經(jīng)元的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DMY抑制活化的小膠質(zhì)細胞向M1型即促炎表型極化，同時促進其向M2型即抗炎表型轉(zhuǎn)化，有效抑制LPS引起的小膠質(zhì)細胞活化。其結(jié)果將有助于對神經(jīng)炎癥的深入了解，為后續(xù)疾病的研究和新藥的開發(fā)提供可靠的實驗數(shù)據(jù)，也進一步確認(rèn)了DMY作為新型神經(jīng)保護劑的可能性及其潛在的神經(jīng)保護機制。