一測多評法同時測定雷公藤提取物中6種成分含量

吳 玨 ，劉志宏 ，林 兵 ，張敏新 ，林莉莉 ，周桂芝 ，宋洪濤

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.聯勤保障部隊第九○○醫院，福建 福州 350025）

雷 公 藤 （Tripterygium wilfordii Hook.f.） 為 衛 矛科雷公藤屬植物，具有祛風除濕、活血化瘀、清熱解毒等功效，并具有較強的抗炎和免疫抑制等藥理活性。在臨床上，雷公藤主要用于治療類風濕性關節炎、腎病綜合征等自身免疫性疾病，療效顯著［1-2］，但其成分復雜，許多有效成分亦是毒性成分，導致不良反應多發且嚴重程度讓患者難以忍受［3-4］，極大程度限制其臨床應用。目前，雷公藤未載入《中國藥典》，質量控制方法不統一，文獻中多以單一成分作為指標報道，如采用HPLC法測定雷公藤甲素、雷公藤紅素或雷公藤內酯甲的含量［5-10］。然而僅測定雷公藤中單一成分的含量，并不能全面反應質量，導致各廠家所生產的雷公藤制劑的藥效和毒性存在差異［11］。本研究以雷公藤甲素為內參物，建立自制雷公藤提取物中6種有效成分雷公藤甲素、雷公藤內酯酮、雷酚內酯、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內酯甲含量同時測定的方法，并對外標法和校正因子法的實測值和計算值進行差異分析，探討一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）在雷公藤各指標成分含量測定中的適用性。

1 實驗材料

1.1 實驗試藥 雷公藤提取物（自制，批號171227、180326、180708）；雷公藤甲素（含量 99.8%，批號：111567-201404）、雷公藤內酯酮（含量98.3%，批號：111972-201501）、雷公藤紅素（含量 97.0%，批號：111946-201501）、雷公藤內酯甲（含量98.1%，批號：111597-200505）均購自中國食品藥品檢定研究院；雷酚內酯（含量98.9%，批號：CHB170704）購自成都克洛瑪生物科技有限公司；雷公藤次堿（含量98.0%，批號：16122331）購自上海同田生物科技有限公司；乙腈、甲酸（色譜純）購自上海科豐實業有限公司；實驗用水均為超純水。

1.2 實驗儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；AL204萬分之一天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；十萬分之一電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；KQ800KDE型高功率數控超聲波清洗器（江蘇昆山超聲清洗公司）。

2 方法與結果

2.1 定量方法的建立

2.1.1 色譜條件 使用Shiseido-CAPCELL PAK CR 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.05%甲酸水溶液（B），進行梯度洗脫（見表1），檢測波長為 218 nm，柱溫為 35℃，流速為 1.0 mL／min，進樣量為 20 μL。分別取混合對照品溶液、供試品溶液，按上述色譜條件進行分析，各成分分離度良好，溶劑無干擾。

表1 梯度洗脫時間表

2.1.2 溶液的制備 ①對照品溶液的制備：分別精密稱定0.33 mg雷公藤甲素對照品、2.38 mg雷公藤內酯酮對照品、17.80 mg雷酚內酯對照品、21.48 mg雷公藤次堿對照品、1.24 mg雷公藤紅素對照品、5.66 mg雷公藤內酯甲，置于25 mL量瓶中，加入少量無水乙醇超聲溶解，再用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。②供試品溶液的制備：精密稱取100 mg自制雷公藤提取物置于10 mL量瓶中，加入少量無水乙醇超聲溶解，再用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.3 線性關系考察 分別精密吸取一系列混合對照品溶液各10 μL進樣，按“2.1.1”項下的色譜條件進行測定。記錄相應的色譜峰峰面積，以峰面積積分值為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線。結果表明各對照品在一定的質量濃度范圍內線性關系良好，見表2。

表2 雷公藤提取物各指標成分的線性方程

2.1.4 精密度考察 取“2.1.2”項下混合對照品溶液連續進樣6次，記錄各色譜峰峰面積，計算RSD分別為 0.23%、0.31%、0.79%、0.66%、0.09%、0.14%，結果表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩定性考察 取同一批次自制雷公藤提取物按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別于配制后0、12、24 h注入液相色譜儀，記錄各組分色譜峰峰面積。結果顯示雷公藤甲素、雷公藤內酯酮、雷酚內酯、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內酯甲峰面積RSD值分別為1.51%、1.33%、2.21%、1.24%、1.33%、1.31%，說明該供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.6 重復性考察 取同一批次自制雷公藤提取物按照“2.1.2”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定分析，記錄雷公藤甲素、雷公藤內酯酮、雷酚內酯、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內酯甲的峰面積，計算其質量分數及RSD。結果測得上述各成分峰面積RSD值分別為1.59%、1.80%、1.41%、2.99%、2.91%、1.83%，表明該方法重復性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗 稱取自制雷公藤提取物6份，每份精密稱取100.0 mg，置圓底燒瓶中，分別精密加入含有與樣品等量的雷公藤甲素、雷公藤內酯酮、雷酚內酯、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內酯甲的混合對照品溶液，按照“2.1.2”項下方法制備加樣回收率試驗供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定，計算溶液中對照品量和各成分加樣回收率。結果表明各待測成分的平均加樣回收率分別為（101.21±1.33）%、（102.49±1.21）%、（98.74 ±3.28）%、（99.10±2.31）%、（100.40±3.40）%、（101.40±1.80）%，結果表明方法準確性較好。

2.2 相對校正因子的計算 精密吸取“2.1.2”項下的混合對照品溶液分別使用不同進樣體積進樣并記錄峰面積， 按公式 fk／s＝fk／fs＝（Wk／Ak） ／（Ws／As）（式中Wk為內參物質量濃度，Ak為內參物峰面積，Ws為其他對照成分質量濃度，As為其他對照成分峰面積），以雷公藤甲素為內參物（k）計算各進樣體積下其他5種成分的相對校正因子fk／s，取其平均值計為該成分對雷公藤甲素的相對校正因子fk／s，結果見表3。

表3 各成分的相對校正因子fk／s值

2.3 雷公藤提取物的含量測定 取 3批自制雷公藤提取物，分別采用外標法和QAMS法測定雷公藤甲素、雷公藤內酯酮、雷酚內酯、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內酯甲的含量，結果見表4，對兩法所測得的各成分含量進行t檢驗，結果無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 相對校正因子耐用性考察

2.4.1 不同儀器和色譜柱的影響及各成分峰定位采用Angilent 1200型高效液相色譜儀、島津LC-20AD型高效液相色譜儀和Shiseido-CAPCELL PAK CR 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱對同一批次自制雷公藤提取物進行實驗，計算相對校正因子fk／s和相對保留時間tR，結果表明不同品牌儀器和色譜柱對雷公藤甲素、雷公藤內酯酮、雷酚內酯、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內酯甲的fk／s無顯著影響，結果見表5；不同儀器和色譜柱測得的相對保留時間結果見表6。

表4 樣品含量測定結果

表5 不同儀器和色譜柱測得的fk／s

表6 不同儀器和色譜柱測得的tR

2.4.2 不同柱溫的影響 分別選取30、35、40℃對同一批次自制雷公藤提取物進行實驗，計算相對校正因子fk／s和相對保留時間tR，實驗結果表明不同柱溫對雷公藤甲素、雷公藤內酯酮、雷酚內酯、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內酯甲的fk／s無顯著影響，結果見表7；不同色譜柱溫度測得的相對保留時間結果見表8。

表7 不同柱溫對fk／s的影響

表8 不同柱溫對tR的影響

3 討 論

本研究建立了QAMS法同時測定自制雷公藤提取物中6種有效成分雷公藤甲素、雷公藤內酯酮、雷酚內酯、雷公藤次堿、雷公藤紅素和雷公藤內酯甲的含量，與外標法測定結果無顯著性差異，fk／s及tR均具有良好的重復性和穩定性。

選擇出峰時間較早的雷公藤甲素為內參物，其藥效明確，穩定性好，且文獻中所報道雷公藤藥材及制劑的質量控制多選擇雷公藤甲素為單一指標成分，可據此對其他成分進行校正。

本研究考察不同色譜柱和柱溫對6種成分之間fk／s及tR的影響，結果無顯著性差異，并且分離度良好，6種成分對溫度具有一定的耐受性，色譜峰出峰先后順序無變化，參照相對保留值并結合光譜圖即可準確、快速定位色譜峰。

單一成分的內在質量評價難以控制復雜多樣的中藥及其制劑，而多指標的質量評價方法對對照品的需求量較大，指紋圖譜雖然可以比較全面地反映中藥的整體性，但其模糊性的特點使真實準確的質量評價存在一定困難，故本實驗建立的一測多評質量評價方法可為雷公藤藥材及其制劑的質量控制提供參考。