慢性HBV攜帶小鼠模型評估

袁慧鑫，郭子寧

（北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078）

2015年國家衛計委發布的信息顯示：我國的慢性HBV感染者約有9 000萬人，其中約2800萬人為慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者［1］。 一般認為，非活動HBV攜帶狀態較CHB更少進展為肝硬化、肝癌；但有研究顯示相比于健康人群，慢性攜帶者出現肝組織病變甚至肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的概率并不低［2］；而且在非活動性HBsAg攜帶者中約有20%～30%可出現自發HBV再活動［3］，年發生率約 1%～3%［4］。 盡管當前的抗病毒藥物能有效抑制HBV復制，但仍面臨HBsAg清除率極低、安全停藥難、耐藥等問題［5］。所以消滅乙肝仍然是現今醫學研究的重要內容。HBV感染具有明顯的種屬限制，目前應用于實驗研究的小鼠和細胞株均是通過轉基因技術獲得的［6］。轉基因小鼠對HBV的相關抗原具有免疫耐受性，處于免疫耐受狀態［7］，而慢性HBV攜帶者的免疫系統亦對HBV特異性無應答。課題組通過轉基因小鼠模型的生化指標、肝組織病理等與慢性HBV攜帶狀態的相似度，以期評估該模型是否適用于慢性HBV攜帶狀態的相關研究。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級環境飼養的C57BL6J-TgN（Alb1HBV）44BriHBV轉基因小鼠，購自北京大學醫學部實驗動物科學部；于1998年2月自美國Jackson Laboratory引進，其轉入的基因片段為HBV ayw亞型的S基因、preS基因以及X基因［8］。

1.2 實驗試劑 ALT、AST生化試劑盒［英科新創（廈門）科技有限公司］；HBsAg、HBeAg 試劑盒（美國雅培公司）；Trizol（美國英杰生命技術有限公司）。

1.3 實驗設備 5417R型臺式低溫高速離心機（Eppendorf公司），AU480型全自動生化儀（日本奧林巴斯株式會社），I2000型化學發光免疫分析儀（美國雅培）；ABI 7900 qPCR儀（美國應用生物系統公司）。

2 實驗方法

2.1 實驗分組 模型組為雄性轉基因8～12周齡10只，對照組為同品系正常小鼠10只，體質量18～22 g。飼養24周后取材，飼養過程中模型組死亡3只，對照組無死亡，統計時于對照組中隨機選取7只小鼠數據進行對比觀察。取材前禁食水12 h，眼眶取血法取血，靜置 1～2 h，10 000 r／min室溫離心10 min，分離血清后保存于－20℃。斷頸椎處死小鼠，75%酒精消毒小鼠尾部，剪取約1 cm，-80℃保存，75%酒精消毒腹部并備皮后打開腹腔，暴露肝臟組織，剪取肝臟后用生理鹽水沖凈，濾紙拭干，置于4%多聚甲醛液中充分固定。

2.2 觀察指標及方法

2.2.1 肝組織HBV DNA檢測 預冷研體，-80℃中取出樣本，加液氮研磨為粉狀，采用TRIzol提取總RNA，按逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA，－20℃保存備用。 反應體系：cDNA 2 μL、qPCR mix 10 μL、primer F 1 μL、primer R 1 μL、ddH2O 6 μL。 反應條件：95 ℃ 2 min、94 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s做40個循環。引物模板序列，HBV：primer F TGGTGT CTTTTGGAGTGTGGAT，primer R TAACATTGAGAT TCCCGAGATTG；β-actin：primer F GCCCTGAGGCT CTCTTC CA，primer R GCGGATGTCGACGTCACA。

2.2.2 血清指標 使用全自動生化分析儀檢測小鼠血清中的AST、ALT含量；使用化學發光免疫分析儀檢測小鼠血清中的HBsAg、HBeAg含量。

2.2.3 肝組織HE染色 肝臟組織經脫水、石蠟包埋后，沿橫斷面連續切片制成厚度0.4 μm切片；進行HE染色，光學顯微鏡下觀察肝組織病理形態并攝片，評估病變程度。

3 結 果

3.1 2組HBV DNA表達比較 模型組小鼠均有HBV DNA表達，見表1。

表1 2組HBV DNA表達比較

3.2 2組HBsAg、HBeAg表達比較 模型組小鼠血清HBsAg、HBeAg表達率均為100%。見表2。

表2 2 組 HBsAg、HBeAg 表達比較（）

表2 2 組 HBsAg、HBeAg 表達比較（）

注：與對照組比較，1）P＜0.05。

組別對照組模型組HBeAg 0.560±0.106 1.606±0.3761）n77 HBsAg 0.017±0.008 112.219±88.4041）

3.3 2組ALT、AST水平比較 見表3。

表3 2 組 ALT、AST 水平比較（）U／L

表3 2 組 ALT、AST 水平比較（）U／L

注：與對照組比較，1）P＜0.05。

組別對照組模型組AST 46.429±4.577 62.857±5.7281）n77 ALT 39.143±2.911 62.857±3.4371）

3.4 肝組織病理 光鏡下對照組小鼠肝組織未見明顯病理改變；模型組小鼠肝細胞排列欠規整，部分肝細胞胞質呈伊紅均染（毛玻璃樣變性），局部可見巨核肝細胞，肝內散在肝細胞壞死伴淋巴樣細胞浸潤，肝竇內可見淋巴樣細胞聚集灶。

圖1 2組小鼠肝組織HE染色圖（×100）

4 討 論

同種轉基因小鼠的前期相關研究提示：該轉基因小鼠ALT、AST等生化指標較同品系正常小鼠明顯升高，且與周齡呈正相關［9］；此模型小鼠肝臟局部可見肝細胞腫脹、毛玻璃樣變性、灶性壞死伴淋巴樣細胞浸潤等病理表現，免疫組化分析提示HB-sAg在肝細胞質沉積［10］；有研究認為肝細胞的炎癥、壞死與HBsAg滯留進而影響肝細胞正常代謝有關［11］。關于 ALT、AST血清水平與肝組織變化，本實驗結果與上述研究相同。

關于慢性HBV攜帶者肝組織病理的臨床研究提示：慢性攜帶者有90.2%存在一定程度的肝組織病變［12］，病變程度與血清 ALT、AST、HBV-DNA 及HBVM（乙肝病毒標志物）水平均無相關性［13］；而肝纖維化程度隨年齡增長加重［14］。

本實驗模型小鼠表達的HBV相關抗原來自受精卵時期的轉入基因，該基因整合于小鼠的染色體，可穩定表達，模型小鼠對HBV相關抗原無免疫應答，這點符合慢性HBV攜帶狀態特點。模型小鼠的肝組織出現損傷，但損傷程度并不重，而臨床上慢性HBV攜帶狀態者肝亦有不同程度的損傷。模型小鼠的肝損傷或許由HBsAg沉積所致，但是否存在自發免疫耐受被打破，進而出現免疫損傷的可能？若是自發激活，或許可借此了解慢性HBV攜帶狀態患者HBV再活動機制，從而為臨床干預提供支持。小鼠是繼人類之后第二個完成基因測序工程的哺乳動物，遺傳背景明確［15］，為進行相關基因調控等研究提供了可能性。綜上所述，課題組認為本實驗采用的C57BL6J-TgN（Alb1HBV）44BriHBV小鼠適用于慢性HBV攜帶狀態相關研究。