基于差異蛋白組學(xué)的活血養(yǎng)血湯干預(yù)兔脊髓缺血再灌注損傷模型作用機制研究

劉 宇 ，張 燕 ，劉俊寧 ，林慶賓 ，陳 鵬

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)骨傷及運動康復(fù)教育部重點實驗室，福建 福州 350122）

脊髓缺血再灌注損傷（spinal cord ischemia reperfusion injury，SCII）多見于脊柱外科及胸腹部手術(shù)后的繼發(fā)性神經(jīng)功能損傷［1］、脊髓神經(jīng)細胞損傷和神經(jīng)功能障礙，甚至出現(xiàn)不可逆性神經(jīng)損害。SCII是受多因素、多途徑、多步驟參與調(diào)控的復(fù)雜性疾病。SCII中醫(yī)病機為“血瘀”和“血虛”互為因果。活血養(yǎng)血湯是已故名老中醫(yī)張安楨教授的經(jīng)驗方，具有活血化瘀、理氣補血養(yǎng)血的功效。課題組前期研究表明活血養(yǎng)血湯對SCII有明確的臨床療效［2］。為進一步探討活血養(yǎng)血湯治療SCII的作用機制，我們應(yīng)用兔SCII模型，采用蛋白組學(xué)技術(shù)篩選出活血養(yǎng)血湯干預(yù)兔SCII模型差異蛋白后，進行生物信息學(xué)分析，從蛋白質(zhì)組學(xué)角度探討活血養(yǎng)血湯改善SCII的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級4月齡新西蘭大白兔12只，雌雄各半，體質(zhì)量（2.5±0.2）kg，動物合格證號：SYXK（閩）2015-0001。委托福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心購買，全程在動物實驗中心兔飼養(yǎng)室標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)1周，期間適時觀察動物生長情況。

1.2 實驗藥物 活血養(yǎng)血湯藥物組成：黃芪9 g，當(dāng)歸 9 g，白芍 9 g，川芎 6 g，制首烏 9 g，續(xù)斷 9 g，太極參 9 g，炙甘草 3 g，骨碎補 9 g，羌活 9 g，獨活9 g。由福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂醫(yī)院藥劑科制備，加工成含生藥量1 g／mL的藥液，無菌保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗試劑 TMT標(biāo)記試劑盒（美國Thermo公司）；BCA試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；乙腈、超純水（美國Fisher Chemical公司）；三乙基碳酸氫銨、二硫蘇糖醇、碘代乙酰胺、三氟乙酸、尿素（美國Sigma公司）；甲酸（瑞士Fluka公司）；蛋白酶抑制劑（德國Calbiochem公司）；胰酶（美國Promega公司）。

1.4 實驗儀器 Waters BreezeTM 2高效液相色譜儀（美國 Waters公司）；Scientific Q Exactive高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo公司）。

2 實驗方法

2.1 動物模型制備 參照 Kwun［3］的造模方法，水合氯醛腹腔注射麻醉。切口選取劍突下3 cm至恥骨聯(lián)合上6 cm，腹部正中切口，皮膚、皮下組織逐層切開，暴露腸管并用無菌輔料保護，推向一側(cè)，小心將腹主動脈下方分離出來，致動脈分叉水平，然后沿腹主動脈走形仔細分離出第3～6腰動脈，用Scoville-Lewis血管夾夾閉，無菌敷料覆蓋，關(guān)閉腹腔，30 min后小心取出血管夾，恢復(fù)血液再灌注1 h，建立兔SCII動物模型，整個過程均在嚴格無菌操作下進行。

2.2 動物分組給藥及取材 按隨機數(shù)字表法分為模型組和藥物組各6只，模型組灌胃生理鹽水，藥物組灌胃活血養(yǎng)血湯1周，余處理同常規(guī)飼養(yǎng)。家兔給藥劑量參照對比人體表面積關(guān)系計算，藥物組按2.45 g／（kg·d）給予活血養(yǎng)血湯灌胃，模型組予等量生理鹽水灌胃，持續(xù)干預(yù)1周。1周后按上述造模方法建立動物模型，阻斷第3～6腰動脈30 min后再灌注1 h后，兔背部正中切開，逐層分離，暴露腰段脊髓并分離，銳性無創(chuàng)截取腰段脊髓組織作為標(biāo)本，迅速放置于－80℃保存。

2.3 提取蛋白 稱取適量擊碎組織標(biāo)本，在液氮充分的研缽中研磨，加入4倍體積的含尿素和含1%蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液行超聲裂解，4℃下12 000 r／min離心10 min，采用BCA試劑盒行蛋白濃度檢測。

2.4 胰酶溶解標(biāo)本 56℃條件下加入二硫蘇糖醇，還原30 min后，添加碘代乙酰胺，使?jié)舛葟? mmol／L 增至 11 mmol／L，室溫下孵育 15 min 后，在37℃下加入胰酶過夜，胰酶與蛋白質(zhì)量比為1∶50，再次加入胰酶，混合胰酶與蛋白質(zhì)量比為1∶100后酶解4 h。

2.5 TMT標(biāo)記及HPLC分級 用Strata X C18將胰酶溶解后的肽段除鹽后冷凍，0.5 mmol／L TEAB溶解肽段，按照TMT試劑盒要求標(biāo)記。

2.6 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析 在液相色譜流動相 A相［0.1%（v／v）甲酸水溶液］條件下溶解肽段后，用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)進行分離，將肽段注入NSI離子源中電離后行Q ExactiveTM Plus質(zhì)譜分析，用數(shù)據(jù)依賴型掃描（DDA）程序進行數(shù)據(jù)采集。

2.7 數(shù)據(jù)庫搜索 使用Maxquant（v1.5.2.8）行二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索，檢索數(shù)據(jù)庫為Uniprot Oryctolagus cuniculus，Trypsin／P方式酶切，最小肽段長度設(shè)為7個氨基酸殘基，修飾最大值為5，漏切位點數(shù)為2，二級碎片離子質(zhì)量誤差為0.02 Da，一級母離子質(zhì)量誤差容忍度分別為20 ppm和5 ppm，可變修飾成為蛋白N端的乙酰化和甲硫氨酸的氧化，定量設(shè)置為TMT-10plex，PSM鑒定和蛋白鑒定的FDR均設(shè)置為1%。

2.8 生物信息學(xué)分析 對分析鑒定到及定量到的差異蛋白行生物信息學(xué)分析，對上述差異蛋白的特征和功能等進行基因本論（Gene Ontology，以下簡稱GO）注釋、亞細胞結(jié)構(gòu)定位、KEGG通路和蛋白結(jié)構(gòu)域（domain）等功能注釋類型的富集分析。

3 結(jié) 果

3.1 差異表達蛋白統(tǒng)計及描述 通過上述差異蛋白組學(xué)方法共篩選出48個差異蛋白，以變化閾值＞1.2倍作為差異標(biāo)準(zhǔn)，上調(diào)蛋白（＞1.2）26個，下調(diào)蛋白（＜0.83）22個。上調(diào)蛋白包括：Fucose mutarotase、Tryptophan-tRNA ligase，cytoplasmic、Sorcin、Argininosuccinate synthase、Coiled-coil domain-containing protein 28A、RELT-like protein 1、Serpin B6、E3 ubiquitin-protein ligase parkin、Exosome complex component RRP43、Microtubule-associated proteins 1A ／1B light chain 3B、Short／branched chain specific acyl-CoA dehydrogenase，mitochondrial、Erythrocyte band 7 integral membrane protein、Syntaxin-binding protein、Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein M、2'，3'-cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase、Calcyphosin、Wiskott-Aldrich syndrome protein family member 1、Retinal dehydrogenase 1、ATP-binding cassette sub-family F member 1、Sec1 family domaincontaining protein 2、Multivesicular body subunit 12B、Peroxi-somal bifunctional enzyme、UPF 0160 protein MYG1，mitochondrial、Ribosomal protein S6 kinase delta-1、Zinc finger and BTB domain-containing protein 47、Hematopoietic lineage cell-specific protein。下調(diào)蛋白包括：Vacuolar protein sorting-associated protein 8 homolog、Protein FAM210B、Serine／threonine-protein phosphatase 6 regulatory subunit 3、A-cyl-CoA dehydrogenase family member 9，mitochondrial、Phenazine biosynthesis-like domain-containing protein、Calcium／calmodulin-dependent protein kinase kinase 1、Acyl-coenzyme A thioesterase 1、NADPH：adrenodoxin oxidoreductase，mitochondrial、Protrudin、Acyl-coenzyme A thioesterase THEM4、Glutathione S-transferase Yb、Triokinase／FMN cyclase、THUMP domain-containing protein 1、Isochorismatase domaincontaining protein 1、D-2-hydroxyglutarate dehydrogenase，mitochondrial、Complement decay-accelerating factor、Laminin subunit beta-1、Serpin B9、Basal cell adhesion molecule、Apolipoprotein A-I、Sushi domaincontaining protein 2、Ketimine reductase mu-crystallin。

3.2 2組差異蛋白在GO二級注釋中的分布情況見表1。

3.3 2組差異蛋白的亞細胞結(jié)構(gòu)定位分布情況見表2。

3.4 KEGG通路富集 富集分析得到的KEGG通路主要在脂肪酸生物合成方面，其中上調(diào)蛋白體現(xiàn)通 路 有 Hexa-decanoyl-Coa、Tetra-decanoyl-Coa、Dodecanoyl-Coa、Decanoyl-Coa、Octanoyl-Coa， 上調(diào)和下調(diào)蛋白共同體現(xiàn)的通路有Hexanoyl-Coa、Butanoyl-Coa。 見圖 1。

3.5 蛋白結(jié)構(gòu)域富集 見圖2。

4 討 論

活血養(yǎng)血湯是活血養(yǎng)血法代表方劑，乃我國已故著名骨傷科大師張安楨教授跟隨福建骨傷科名醫(yī)林如高老先生多年，總結(jié)其臨床經(jīng)驗，在林老先生經(jīng)驗方理氣補血湯基礎(chǔ)上化裁而來。前期研究表明，理氣補血湯可促進神經(jīng)修復(fù)再生，提高神經(jīng)功能恢復(fù)，臨床多用于神經(jīng)損傷疾病的治療［2］。SCII作為中樞神經(jīng)損傷疾病，損傷造成的主要因素非缺血本身，而是缺血一段時間以后又突然恢復(fù)供血，從而造成的二次損傷。中醫(yī)辨證屬“血瘀”和“血虛”。“血瘀”“血虛”互為因果，“血瘀”導(dǎo)致氣血不通，氣血無法接續(xù)，從而加重“血虛”，而“血虛”必然導(dǎo)致氣血兩虛，氣虛無力推動血行，血液運行不暢，加重“血瘀”，惡性循環(huán)，逐漸加重疾病發(fā)展。活血養(yǎng)血湯中當(dāng)歸、白芍、川芎為君藥，當(dāng)歸活血化瘀，白芍養(yǎng)血柔肝斂陰，川芎行氣活血，三者共同達到活血行氣的作用；臣藥為黃芪、制首烏、太極參、續(xù)斷、骨碎補，黃芪、太極參、制首烏補氣養(yǎng)血，續(xù)斷、骨碎補補肝腎、壯筋骨；羌活、獨活為佐藥，舒筋活絡(luò)；炙甘草為使藥，調(diào)和諸藥。以上諸藥配伍，以達到活血養(yǎng)血、補肝腎壯筋骨的目的。

表1 2組差異蛋白在GO二級注釋中的分布情況

表2 2組差異蛋白的亞細胞結(jié)構(gòu)定位分布情況

蛋白質(zhì)組一詞是由澳大利亞學(xué)者MarcWilkins于1994年最先提出，是指基因表達的全部蛋白質(zhì)，或細胞組織機體在特定時間和空間表達的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)的建立為在蛋白質(zhì)水平上研究生命活動和人類疾病提供了嶄新的技術(shù)手段，將對細胞功能展開更深入的研究［4-6］。本實驗通過將TMT標(biāo)記、高效液相色譜分級技術(shù)以及基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等一系列前沿技術(shù)進行有機結(jié)合，對活血養(yǎng)血湯干預(yù)兔SCII模型脊髓組織進行定量蛋白組的研究，然后篩選差異表達蛋白進行GO注釋、亞細胞結(jié)構(gòu)定位、KEGG通路和蛋白結(jié)構(gòu)域等相關(guān)聯(lián)蛋白的生物信息學(xué)分析。

GO對蛋白質(zhì)組學(xué)層面的注釋來源于UniProt-GOA 數(shù)據(jù)庫（http： ／／www.ebi.ac.uk／GOA ／）。 使用預(yù)測亞細胞定位的軟件wolfpsort對所提交的蛋白進行亞細胞定位注釋［5，7-8］，使用 KEGG 通路數(shù)據(jù)庫對蛋白通路進行注釋：首先，使用KEGG在線服務(wù)工具KAAS對提交的蛋白進行注釋，之后通過KEGG mapper將注釋過的蛋白匹配入數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)的通路中。使用基于蛋白序列算法的軟件InterProScan以及相應(yīng)的InterPro結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫對鑒定到的蛋白質(zhì)進行蛋白結(jié)構(gòu)域注釋。GO即基因本論，是一個重要的生物信息學(xué)分析方法和工具，用于表述基因和基因產(chǎn)物的各種屬性。GO注釋分為3個一級大類：生物進程、細胞組成和分子功能，從不同角度闡釋蛋白的生物學(xué)作用。我們對定量到的蛋白質(zhì)在GO二級注釋中的分布進行統(tǒng)計。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域是指在不同蛋白質(zhì)分子中重復(fù)出現(xiàn)的某些組分，具有相似的序列、結(jié)構(gòu)和功能，是蛋白質(zhì)進化的單元，結(jié)構(gòu)域的長度通常在25個氨基酸和500個氨基酸長度之間。KEGG是連接已知分子間相互作用的信息網(wǎng)絡(luò)，如代謝通路、復(fù)合物、生化反應(yīng)，KEGG途徑主要包括：代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細胞過程、人類疾病、藥物開發(fā)等，富集分析得到的KEGG通路可以網(wǎng)頁形式進行可視化展示。

圖1 2組差異表達蛋白顯著富集的某KEGG通路可視化展示圖

圖2 上調(diào)蛋白（A）和下調(diào)蛋白（B）的蛋白結(jié)構(gòu)域富集圖

實驗結(jié)果表明，2組比較差異表達蛋白中上調(diào)26個，下調(diào)22個。GO注釋分類統(tǒng)計結(jié)果表明，上調(diào)和下調(diào)蛋白均在生物進程中單一生物過程、代謝過程和生物調(diào)節(jié)上表達明顯；上、下調(diào)蛋白在細胞組成方面主要集中在細胞器和細胞膜中；在分子功能方面上以粘附和催化活性表達為主。亞細胞結(jié)構(gòu)定位結(jié)果表明上、下調(diào)蛋白均在細胞質(zhì)上有最多體現(xiàn)。KEGG通路上調(diào)蛋白主要體現(xiàn)在上皮細胞的細菌侵襲，下調(diào)蛋白主要體現(xiàn)在阿米巴病元通路上。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域上調(diào)蛋白集中體現(xiàn)在Rossmann-like alpha／beta／alpha sandwich fold， 而下調(diào)蛋白體現(xiàn)在硫酯酶結(jié)構(gòu)域等8個方面。

活血養(yǎng)血湯為名老中醫(yī)經(jīng)驗方，該方對于脊髓神經(jīng)損傷有較好的臨床療效［2］。本實驗從蛋白組學(xué)角度出發(fā)，研究活血養(yǎng)血湯干預(yù)兔SCII模型差異蛋白的表達，并對篩選出的差異蛋白進行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，進一步闡明其作用靶點，為后續(xù)研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。