非洲豬瘟的抗體檢測

文│中國動物疫病預防控制中心

血清學檢測技術因其簡便、低成本和無須特殊的儀器設備，而成為最常用的檢測技術。由于非洲豬瘟（ASF）尚沒有可用的疫苗，非洲豬瘟病毒（ASFV）抗體陽性即表明當前或者曾經發生了感染。此外，ASFV抗體在感染早期即可出現，并持續數年。然而，在特急性和急性感染中，豬通常在抗體轉為陽性前已死亡。因此，在疫病暴發的早期階段，建議采集樣品檢測病毒DNA。

對于檢測ASF抗體，推薦使用ELISA篩查抗體陽性樣品，并采取免疫印跡試驗（IB）或間接熒光抗體試驗進行確認。此外，間接免疫過氧化物酶的抗體檢測技術也可用作豬血清和組織滲出物中ASF抗體檢測的替代試驗。該技術也適用于大量樣品的檢測，而無須昂貴的熒光顯微鏡設備，且敏感性較高。

一、ELISA對非洲豬瘟抗體的檢測

ELISA是一種常用的檢測技術，廣泛用于多種動物疫病的大規模血清學調查。該方法的顯著特點是靈敏度高、特異性好、速度快、成本低，結果清晰。借助于自動化設備的使用，可以實現大量樣品的快速篩選。

ELISA使用標記物檢測血清樣品中的ASF抗體。ELISA使用的標記通常是某種酶。當抗原和抗體彼此結合時，酶引起底物發生顏色變化，從而鑒定ASF陽性樣品。目前，多種用于ASF抗體檢測的間接或阻斷ELISA已實現商品化供應，或者由實驗室“自主”建立。

血清處理或保存不當（儲存或運輸不當），如溶血樣品可能會產生高達20%的假陽性結果。因此，通過ELISA檢測的所有陽性和可疑樣品必須通過其他血清學替代試驗確認。

IB技術是用于蛋白質檢測和鑒定的快速、靈敏的檢測技術。IB技術的原理是抗原抗體的特異性結合。IB技術中使用了覆蓋有病毒抗原的紙條，首先是抗原溶解、電泳分離以及轉移到薄膜上（通常是硝化纖維素膜），之后與特異性一抗反應，再與標記二抗作用后，產生可直接觀察的陽性反應條帶（見圖1）。

◎圖1 通過免疫印跡試驗（IB）檢測ASF抗體

◎圖2 間接熒光抗體（IFA）對ASF抗體的檢測

ASFV感染后首先刺激機體產生抗體的多種病毒蛋白，通過在IB試驗，可在所有感染動物中標定地檢測到。動物感染后7～9天血清轉陽，并可在康復動物體內存在幾個月。接種其他病毒疫苗的動物血清，可能會產生非特異性反應，因此需要借助于如IPT或者FAT等技術進行確認。

二、間接熒光抗體試驗(IFA)對非洲豬瘟抗體的檢測

該技術的原理是用具有細胞適應性的ASFV毒株，感染單層綠猴腎細胞，再通過特異性抗原抗體反應實現對ASF抗體的檢測。抗原抗體反應通過耦聯的熒光素進行檢測。陽性樣品在感染細胞的胞漿中出現特異性熒光。IFA是一種快速、高度敏感和特異的ASF抗體檢測技術，適用于血清、血漿或組織分泌物中抗體的檢測（圖2）。

三、間接免疫過氧化物酶試驗對非洲豬瘟抗體的檢測

免疫過氧化物酶試驗（IPT）是一種細胞免疫化學技術，細胞固定后通過耦聯的過氧化物酶實現抗原抗體復合物的檢測。在IPT反應過程中，綠猴腎細胞感染了適應于這些細胞的ASFV適應株。感染細胞首先被固定，之后用作抗原以確定樣品是否存在針對ASF的特異性抗體。與FAT檢測一樣，IPT是具有高度的敏感性和特異性的快速檢測技術，適用于從血清、血漿或組織滲出液中檢測ASF抗體。但因為采用了酶學顯色系統，其結果判定比FAT更為簡單（圖3）。

◎圖3 間接免疫氧化物酶試驗（IPT）對ASF抗體的檢測

綜上所述，目前可用的診斷技術可通過綜合病毒和抗體檢測來確診ASF。實時熒光PCR是最廣泛應用的病毒學診斷技術，可敏感、特異、快速地實現ASFV核酸的檢測。

由于存在交叉污染的可能，來自無疫區的單個動物（例如野豬）的PCR陽性或在一群動物中出現的單個PCR陽性樣品，應采取其他的病毒檢測方法，以及結合血清學、病理學和流行病學調查的結果綜合確診。由于PCR所檢測到的陽性是病毒核酸陽性，而不是感染性病毒粒子，因此，在PCR之外，強烈推薦用新的方法確定感染地區。在報告發生疫情前，先從感染樣品中分離獲得病毒以確認。

雖然經過驗證的ELISA是檢測ASF抗體的候選技術，特別是對血清樣品的初步篩查，但應時刻注意檢測的局限性。應使用其他確證試驗，如IB、IFA或IPT，以發現ELISA檢測中的假陽性樣品。此外，IFA和IPT是組織滲出液和血漿樣品檢測的首選技術，因為他們能完整展示流行病學過程，并可確定感染的具體時間。

表1 ASF實驗室診斷技術一覽表（譯者注：XXX代表最高，X代表一般）

ASF準確的診斷必須包括病毒學和血清學檢測結果，同時結合臨床、病理和流行病學的調查結果。表1總結了ASF的主要實驗室診斷技術及其特性。（注：本文節選自《聯合國糧食及農業組織（FAO）動物生產及衛生手冊》）