綠色熒光蛋白瞬時(shí)表達(dá)的融合蛋白構(gòu)建方法

王顏

摘要：葉綠體是植物細(xì)胞的重要細(xì)胞器，是植物光合作用的場所。每個(gè)葉綠體蛋白質(zhì)按照其功能分布在葉綠體的不同區(qū)域。根據(jù)結(jié)構(gòu)組成和生化特性將葉綠體分成3個(gè)部分，葉綠體被膜、葉綠體基質(zhì)和類囊體。植物蛋白的亞細(xì)胞定位是功能基因組學(xué)的重要內(nèi)容。近幾年來，常用的葉綠體蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位方法是以GFP及其突變體為報(bào)告基因的融合報(bào)告基因定位法。綜述了基于綠色熒光蛋白瞬時(shí)表達(dá)的融合蛋白構(gòu)建方法以及植物材料選擇，同時(shí)進(jìn)行比較和分析，并改進(jìn)不足之處。

關(guān)鍵詞：葉綠體蛋白質(zhì)；融合蛋白構(gòu)建

葉綠體是植物所特有細(xì)胞器，是光合作用的重要場所。據(jù)估計(jì)在高等植物中大約有21000-25000個(gè)蛋白，葉綠體蛋白占蛋白總數(shù)的10%-25%[1]，充分說明了葉綠體對植物的重要性。由于葉綠體是半自主性細(xì)胞器，其葉綠體蛋白大部分都是由核基因編碼，小部分由葉綠體基因編碼[2-3]。葉綠體蛋白主要分為以下幾種，葉綠體膜蛋白、葉綠體基質(zhì)蛋白、類囊體膜蛋白和類囊體腔蛋白。根據(jù)生化特性以及結(jié)構(gòu)組成將葉綠體分為以下3個(gè)部分：由內(nèi)被膜和外被膜構(gòu)成的葉綠體被膜、葉綠體基質(zhì)、類囊體膜和類囊體腔組成的類囊體[4]。

本研究對近幾年常用的葉綠體蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位融合蛋白構(gòu)建方法以及植物宿主載體選擇歸納總結(jié)、提出優(yōu)缺點(diǎn)并對不足之處進(jìn)行改進(jìn)，為得到更高效的葉綠體蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位方法提供信息。

1.融合蛋白構(gòu)建方法

1.1農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。其轉(zhuǎn)化原理是將攜帶外源基因的DNA插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌感染組織細(xì)胞，使外源基因整合到植物的基因組中，再利用細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)得到轉(zhuǎn)基因植株[5]。從當(dāng)前國內(nèi)外研究現(xiàn)狀來看，葉綠體蛋白質(zhì)定位的植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)的浸花法和葉片注射法應(yīng)用較為廣泛。

1.1.1浸花法

浸花法是近幾年發(fā)展起來的一種快速、高效、穩(wěn)定的非組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因方法，是由Clough和Bent在真空滲透法的基礎(chǔ)之上演變而來[6]。真空滲透法是將農(nóng)桿菌菌液與植株放置在真空條件下進(jìn)行侵染，而浸花法不需要進(jìn)行真空處理，只需將農(nóng)桿菌菌液與植株直接接觸即可。

1.1.2注射法

收集農(nóng)桿菌菌液于2mL離心管，4000r/min離心5min，去上清，加0.8mL重懸液（MES 2.132g/L，MgCL2？6H2O 2.033g/L，pH=5.6，使用前加入200μmol/L乙酰丁香酮，50mL LB液體培養(yǎng)基加100μL乙酰丁香酮）重新懸浮；菌液濃度OD600值調(diào)整到0.8，放置1-3h；用無菌注射器將菌液注射到煙草葉片的下表皮，噴適量水，套保鮮袋，放置在22℃的溫室中，用19h的光照和6h的黑暗交替培養(yǎng)；次日揭保鮮袋，培養(yǎng)3-7d，用激光共聚焦顯微鏡觀察[10]。

1.2 PEG轉(zhuǎn)化法

PEG（聚乙二醇）是1種高分子化合物，在20%-25%的濃度下去壁的受體細(xì)胞原生質(zhì)體迅速縮水，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆破壞前去掉PEG，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)就會(huì)又回復(fù)到穩(wěn)定狀態(tài)。

在此過程中，由于PEG可以與Ca2+等陽離子連接，Ca2+能在PEG和帶負(fù)電荷的質(zhì)粒DNA之間形成橋，從而促進(jìn)外源基因進(jìn)入到原生質(zhì)體內(nèi)[12]。該方法的詳細(xì)過程是，用解剖刀將幼嫩的葉片切成約0.5mm2大小的絲狀，放入10ml的酶解液中處理，酶解液為CPW鹽溶液加入了纖維素酶R10、離析酶MR10、甘露醇和MES，pH調(diào)制5.8，真空處理30min，在26℃氣浴恒溫振蕩器內(nèi)40r/min避光震蕩；用過濾網(wǎng)洗去未完全消化的沉淀物，700r/min離心5min；采用 PEG法轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，100μL原生質(zhì)體溶液和10μg質(zhì)粒，然后加入110μL 50%PEG溶液（9.1%甘露醇、10% CaCl2、40%PEG4000）慢慢混勻靜置30min，用W5溶液將混合物再次清洗3次，清洗后將混合物放置在25℃條件下暗培養(yǎng)16h，使用激光共聚焦顯微鏡觀察觀察基因表達(dá)情況.

2.結(jié)論與展望

由于葉綠體自帶紅色熒光，在亞細(xì)胞定位時(shí)要選擇與紅色反差較大的綠色或黃色熒光蛋白基因構(gòu)建表達(dá)載體。煙草和擬南芥都是表達(dá)外源植物基因常用的遺傳轉(zhuǎn)化材料，苗齡6-8周的煙草葉片和苗齡3-4周的擬南芥葉片，葉綠體含量多，細(xì)胞活性強(qiáng)，容易觀察。葉綠體蛋白質(zhì)亞細(xì)定位與功能發(fā)揮緊密聯(lián)系，細(xì)胞功能的發(fā)揮需要不同分區(qū)蛋白質(zhì)之間的相互作用、修飾以及動(dòng)態(tài)變化等調(diào)控活動(dòng)來體現(xiàn)。因而，從靜態(tài)定位研究發(fā)展到動(dòng)態(tài)定位研究，成為蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位研究的新挑戰(zhàn)。隨著轉(zhuǎn)化方法的改進(jìn)、研究技術(shù)的提高以及數(shù)據(jù)庫的不斷完善，葉綠體蛋白質(zhì)定位和功能的研究會(huì)更加清晰。為進(jìn)一步對葉綠體在植物生長發(fā)育，遺傳代謝的相關(guān)研究打下了基礎(chǔ)。

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