突變體p53相關的復合物在乳腺癌中的作用

章 杰，段秀慶

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院乳腺外科，哈爾濱 150001)

乳腺癌是全球女性最常見的癌癥之一，是女性因癌癥死亡的最主要原因。據統計，全球女性乳腺癌新診病例170萬例，占全部女性惡性腫瘤發病的25%，死亡52.19萬例，占全部女性惡性腫瘤死亡的15%[1]。在我國，乳腺癌是危害女性生命健康最主要的惡性腫瘤之一，發病率居于女性惡性腫瘤首位，且近年來呈上升趨勢[2]。p53基因是乳腺癌最常見的突變靶點，其突變與腫瘤惡性程度以及預后相關[3]。根據癌細胞突變目錄，約23%的乳腺癌中存在突變體p53(mutant p53，mutp53)，在基底樣乳腺癌中高達80%[4]。p53突變在乳腺癌發展中的重要意義已經在遺傳性腫瘤易感疾病Li-Fraumeni綜合征中證實[5]。最常見的p53突變是錯義突變，導致蛋白中單個氨基酸的取代[3,6]。大多數錯義突變發生在p53的DNA結合域內，其削弱了與靶基因啟動子序列的相互作用，導致p53轉錄活性和相關腫瘤抑制功能的喪失。最重要的是，p53結構核心的改變可能會嚴重影響與其他蛋白質的作用，這可能是mutp53獲得致癌活性的關鍵，這種現象被稱為功能獲得(gain of function,GOF)[6]。現對mutp53形成的蛋白復合物在乳腺癌中的作用進行綜述。

1 Mutp53與致癌性

在乳腺癌中，促進原發腫瘤生長、存活及轉移的機制可能與mutp53的GOF關聯[6]，部分此類致癌功能歸因于mutp53與其他轉錄因子的相互作用，啟動特殊的基因表達程序。此外，部分mutp53的致癌活性依賴于與分子伴侶的相互作用。蛋白質與蛋白質的相互作用可能是mutp53 GOF的關鍵。

在惡性腫瘤中，除構象改變外，mutp53的積累對其致癌性也是至關重要的，mutp53含量的增加有利于致癌復合物的合成[7]。乳腺癌進展中，mutp53在由無定形聚集體、寡聚體以及淀粉樣蛋白原纖維組成的異常蛋白復合物中積累[8]，在這些mutp53相關的聚集體中發現的幾種蛋白質參與了細胞代謝、炎癥反應、RNA加工、蛋白質和氧化應激調節等致癌過程。一般認為，腫瘤促進因子與mutp53相作用能增強mutp53的致癌活性，而腫瘤抑制因子與mutp53相作用能破壞其抑制腫瘤生長的作用[6]。在乳腺癌模型中也能檢測到mutp53蛋白的相互作用[9]。

2 mutp53與轉錄因子

mutp53可改變癌細胞的基因表達譜[6,9]。雖然mutp53與DNA結合的共有序列尚未確定，但mutp53能與轉錄因子相作用，增強或抑制這些轉錄因子的正常活性，從而改變其靶基因表達譜[6]。在人乳腺癌細胞中，mutp53與轉錄因子E2F1的結合導致ID4轉錄激活，從而促進乳腺癌組織新血管形成[10]。mutp53與E2F4的結合導致涉及DNA修復的基因下調[11]，從而促進細胞存活、逃避細胞凋亡。對人乳腺癌細胞系的研究表明，低水平的DNA損傷后，mutp53與NFY相作用改變了細胞周期檢查點[12]。DNA TopBP1募集mutp53和輔因子p300，介導它們與NFY結合，并刺激癌癥的化學抵抗、周期進展以及細胞增殖。Krishnan等[13]的研究表明，致癌共調因子PELP1是在DNA損傷后的NFY靶基因上高效募集mutp53所必需的。在三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)細胞模型中，PELP1的敲除改善了細胞對化療的反應，抑制了細胞周期進程，激活了細胞凋亡。

在mutp53-NFY的分子通路中，另一種轉錄因子YAP也發揮著重要作用。YAP是組織生長的主要調節因子，在人腫瘤細胞中形成了YAP-NFY-mutp53復合物,促進與腫瘤細胞存活和增殖相關的基因轉錄，也可增強癌細胞的侵襲性[14]。這種復合物在乳腺癌中的功能受脂質代謝和機械轉導的精細調節。首先，無論是在正常生理狀態下還是惡性腫瘤中，YAP的活化均受甲羥戊酸途徑調控[15]，而他汀類藥物可以抑制甲羥戊酸途徑，抵抗YAP/TAZ核活性，鈍化mutp53的致癌潛力[14-15]。其次，乳腺癌細胞中mutp53的積累是由甲羥戊酸途徑下游的RhoA香葉基香葉基化來維持的，香葉基轉移酶1抑制劑能模擬他汀類藥物的作用，抵抗mutp53 GOF[16]。mutp53與細胞脂質穩態間依賴膽固醇調節元件結合蛋白(sterol-regulatory element binding protein，SREBP)家族的轉錄因子，調節脂肪酸和膽固醇的生物合成，從而增強甲羥戊酸途徑以及增加脂肪酸中間體。mutp53與SREBP2形成復合物，增強SREBP靶基因的表達，通過誘導甲羥戊酸途徑影響癌細胞代謝，導致正常乳腺組織結構破壞[17]。此外，mutp53-SREBP復合物間接增強了核定位和處于正反饋環路中YAP/TAZ的活化[15]。因此，通過與YAP、NFY以及SREBP形成復合物，mutp53可以協調脂質代謝、調節致癌轉錄程序，有利于腫瘤生長和轉移。

mutp53還可通過上調蛋白酶影響細胞穩態，對腫瘤抑制機制產生負面影響。該作用至少部分依賴于mutp53與TNBC細胞中特有的轉錄因子Nrf2的相互作用。由蛋白酶抑制或氧化劑誘導蛋白質應激時，mutp53與Nrf2結合可增強蛋白酶基因的轉錄[18]，這減輕了蛋白質負荷，并有利于控制增殖和凋亡相關蛋白酶的降解，從而導致致癌基因表達。Lisek等[19]研究發現，mutp53-Nrf2不僅促進了蛋白酶亞基的表達，而且還協調特定亞群Nrf2依賴性抗氧化反應基因的轉錄，促進乳腺癌細胞的存活。mutp53還可通過激活野生型p53蛋白的轉錄抑制因子，增強癌細胞對蛋白毒性的耐受性。野生型p53能負調節熱激轉錄因子1的細胞保護功能，誘導DNA損傷后細胞的衰老。在TNBC細胞中，mutp53通過與熱激轉錄因子1相互作用，促進熱激蛋白(heat shock protein，HSP)的轉錄，并廣泛增強熱激轉錄因子1致癌信號，從而為腫瘤細胞提供生長優勢[20]。

3 mutp53與腫瘤抑制性

mutp53與轉錄因子的相互作用也可以是抑制性的，mutp53可抑制p53家族的其他成員——p63和p73。研究表明，p53核心結構域構象的變化可影響p53與p63/p73間的作用[21]。mutp53作用于p63，損害TAp63轉錄活性，阻礙其抑制轉移的功能[22]。在其他合作分子以及內在和外在信號的參與下，mutp53可抵抗p63的腫瘤抑制性[23]。在人和鼠細胞模型中，轉化生長因子-β與Ras協同作用以誘導mutp53-TAp63復合物的組裝，其中Smad2作為必需平臺，促進mutp53和TAp63的相互作用[23]。mutp53-TAp63復合物抑制兩種p63相關的轉移抑制因子即Sharp1和細胞周期蛋白G2的表達，增強腫瘤細胞的侵襲性[23]。同樣，Pin1的異構化有利于mutp53與TNBC細胞中TAp63的相互作用[24]。mutp53不僅能抑制p63轉錄活性，還能增強α5β1整合素和表皮生長因子受體的再循環，激活了Rho和蛋白激酶B，最后促進癌細胞遷移和侵襲[20]。整合素/受體再循環介導的磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B信號轉導通路的增強也促進WIP基因(wound-induced protein)的激活，通過增強YAP/TAZ的穩定性刺激致癌[25]。

mutp53還與多種p73亞型相互作用，影響mutp53的轉錄活性，并抵抗細胞凋亡[26]。各種錯義mutp53(R175H，Y220C和R248W)與人類癌細胞中的p63和p73結合，破壞了靶基因的反式激活[27]。在轉基因小鼠中，mutp53(R172H)在乳腺中的穩定表達降低了DNA損傷誘導的細胞凋亡， 通過藥物抑制mutp53及再激活p73可恢復正常細胞凋亡[28]。研究表明，mutp53通過阻止p73對轉錄因子NFY的抑制作用增強腫瘤轉移，提高侵襲性血小板衍生生長因子受體β因子的表達[29]。

4 Mutp53與染色質

Mutp53可通過與非序列特異性轉錄因子的核蛋白相作用干擾細胞凋亡并促進乳腺癌細胞存活。mutp53與核酸酶Mre11的相作用，通過在小鼠的人化p53等位基因中引入突變，導致mutp53蛋白高表達，破壞DNA雙鏈斷裂過程中Mre11-Rad50-NBS1(nijmegen breakage syndrome 1)復合物的形成，從而導致腫瘤細胞增殖過程中共濟失調毛細血管擴張突變功能受損和mutp53的累積。因此，在攜帶mutp53的乳腺癌患者中可觀察到染色體異常的細胞數量明顯增加[30]。

在人乳腺癌細胞系中，另一種mutp53 GOF涉及mutp53與SWI-SNF(switch/sucrose non-fermentable)染色質的相互作用。通過這種作用，mutp53可能會影響乳腺癌中染色質的狀態和基因轉錄。SWI-SNF復合物將全基因組與轉錄調控元件聯系起來，調節核小體占位。SWI-SNF-mutp53三元復合物增強了血管內皮生長因子受體2信號，而且SWI/SNF的功能影響多個mutp53靶基因，這表明該復合物廣泛作用于mutp53依賴性的基因調控[31]。

5 Mutp53與細胞質

細胞質可減弱或擴增不同的細胞信號通路，并且是信號通路相互聯系的地方。mutp53的部分GOF活性是通過mutp53與細胞質中信號轉導相關的介質結合而獲得的。mutp53可與人乳腺癌細胞細胞質中的腫瘤抑制因子DAB2IP(DAB2 interacting protein)結合。DAB2IP是細胞質中Ras GTP酶激活蛋白，也可作為信號支架調控細胞對多種信號的反應[32]。DAB2IP與mutp53蛋白直接結合干擾了DAB2IP的生理作用，改變了細胞對胞吞的反應。 mutp53-DAB2IP復合物促進炎癥刺激，減少腫瘤壞死因子誘導的促凋亡的細胞凋亡信號調節激酶1-c-Jun氨基端激酶軸的激活，從而促進侵襲性核因子κB轉錄因子的激活，最終促進乳腺癌轉移[33]。同樣，mutp53介導的DAB2IP阻斷作用促進胰島素誘導的磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B通路激活，增強非激素依賴性乳腺癌和前列腺癌細胞的增殖和侵襲[33]。

mutp53的GOF也與mutp53和細胞質中依賴cAMP的蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase，AMPK)的作用有關。AMPK可調節合成代謝和分解代謝之間的平衡，在應激狀態下，mutp53優先與AMPKα亞基結合，并抑制AMPK活化，從而影響代謝檢查點，增加合成代謝，促進腫瘤的生長與進展[34]。

Yue等[35]的研究表明，mutp53可以與多種人類腫瘤細胞細胞質中單體GTP酶蛋白家族的成員結合，如mutp53可與Rac1結合并激活Rac1。Rac1是一種調節各種細胞增殖,細胞骨架重組以及細胞遷移的小GTP酶。類泛素蛋白修飾分子(small ubiquitin-like modifier，SUMO)化對于維持Rac1的活性至關重要，而SUMO特異性蛋白酶1可使Rac1去SUMO化，導致Rac1失活[36]。mutp53與Rac1的相互作用抑制了SENP1介導的Rac1去SUMO化， 從而促進Rac1依賴性的腫瘤的生長和轉移[35]。

6 Mutp53的穩定性和激活

結合mutp53的因子也可以促進mutp53穩定和激活，從而驅動mutp53致癌GOF。

6.1Mutp53穩定性的調節因子 Mutp53致癌活性的一個重要條件是在癌細胞中的明顯積累。首先，E3泛素連接酶能泛素化mutp53，使mutp53失去致癌活性，而在癌細胞中mutp53能避開E3介導的泛素化，導致大量積累。其次，mutp53通過與MDM2、CHIP以及Cop1結合，控制其自身水平[37]。mutp53通過與HSP90結合，使mutp53蛋白免受CHIP和MDM2介導的泛素化。mutp53與MDM2和HSP90形成三元復合物，DNA損傷后，MDM2被釋放，而mutp53保留在HSP90復合物中并免于被降解。因此，該復合物的去穩定化有利于腫瘤細胞中mutp53的降解[38]。此外，HSP70也能結合mutp53，并部分抑制MDM2相關的泛素化。在穩定表達人mutp53的乳腺癌細胞和小鼠胚胎成纖維細胞中，HSP70的高表達促進mutp53-p73-HSP70聚集體的形成，阻礙p73依賴性的細胞凋亡[39]。Bcl-2相關抗凋亡基因2和Bcl-2相關抗凋亡基因5與乳腺癌中的mutp53相互作用，有利于mutp53蛋白的積累和GOF[40]。

6.2Mutp53活性的調節因子 mutp53的活性也可通過翻譯后修飾調節。Plk2能調節mutp53的轉錄活性。在人類細胞模型中，Plk2結合并磷酸化mutp53以響應DNA損傷，促進細胞周期基因上p300-NFY-mutp53復合物的形成，從而有利于腫瘤進展和化學感受。mutp53本身也能誘導轉錄Plk2，從而加強了此GOF通路[41]。mutp53的功能可通過脯氨酰異構酶Pin1調節。在乳腺癌細胞中，Pin1介導的異構化增強了mutp53的致癌活性，可能是由于Pin1介導的異構化增強了mutp53與TAp63的相互作用，從而增加了mutp53的表達，促進癌細胞增殖和侵襲[24]。 mutp53的致癌功能也受Pontin的調控。Pontin是一種參與多種生物過程如細胞能量代謝、轉錄、染色質重塑以及DNA損傷反應等的ATP酶，Pontin能促進mutp53介導的多種腫瘤細胞的遷移、侵襲以及相關基因轉錄的上調[42]。Pin1和Pontin對mutp53的作用相似，它們都可能是開發鈍化mutp53 GOF藥物的重要靶點。

7 Mutp53與靶向治療

mutp53的致癌特性和其與其他蛋白質形成復合物的能力密切相關。直接或間接參與DNA轉錄或信號轉導的下游靶點也可以是控制mutp53穩定性和活性的上游調節劑。破壞mutp53復合物的藥物可能是治療癌癥的主要靶點，這些藥物的作用機制主要包括mutp53結構去穩定以恢復其野生型功能，破壞具有特定靶蛋白的致癌復合物，降低mutp53的積累。

目前已經開發了多種用于mutp53去穩定化、失活或再激活野生型p53功能的化合物。如PRIMA-1(p53 reactivation and induction of massive apoptosis-1)及其類似物PRIMA-1Met可以重新折疊各種p53突變體，恢復野生型DNA結構并誘導細胞凋亡。在動物模型中，PRIMA-1Met能抑制癌癥進展，且目前正在臨床試驗中。 其他小分子，如NSC59984，可以以p73依賴的方式選擇性殺死攜帶mutp53的癌細胞。這些小分子在與mutp53的相互作用中釋放p73，促使癌細胞死亡[43]。

也可通過破壞mutp53 GOF中涉及的復合物發揮抗癌作用。如使用嵌合“誘餌”蛋白(GFP-KA2)置換mutp53-DAB2IP復合物。在乳腺癌細胞模型中，這種誘餌蛋白的表達抑制了癌細胞的侵襲、生長和轉移[33]。用于干擾mutp53形成異常復合物的肽或核苷酸適體可能在乳腺癌的靶向治療中也具有一定的作用[34]。防止mutp53與關鍵轉錄伴侶(如NFY、SP1、TAp63、p73)相互作用的藥物在減緩癌癥進展中也具有一定作用。他汀類藥物可通過甲羥戊酸途徑調節SREBP2-mutp53復合物，從而誘導mutp53降解和功能喪失[15]。在臨床前模型中，他汀類藥物抑制了攜帶mutp53的乳腺腫瘤進展。

通過破壞mutp53穩定性和活性，使mutp53蛋白復合物去穩定化，從而治療腫瘤。在體內腫瘤中，通過17-AAG或Ganetespib阻斷HSP90的功能促進了mutp53的降解，有利于誘導細胞凋亡[44]。Ganetespib的功效正在臨床試驗評估中，其具有良好抗腫瘤前景，特別是在肺癌和轉移性乳腺癌中[45]。Pontin特異性ATP酶抑制劑Rottlerin也對含有mutp53的腫瘤產生效應，減少了細胞遷移、增殖以及致癌mutp53靶基因的表達[40]。在臨床前乳腺癌模型中，使用特異性Pin1抑制劑能夠降低mutp53/Pin1致癌能力，表現出強大的腫瘤抑制作用[46]。

兩種以上靶向藥物聯合使用可增強對mutp53 GOF的干預作用，增加藥物的抗癌作用。mutp53-Nrf2復合物能增加蛋白酶體亞基的表達，從而增加乳腺癌細胞中蛋白質的周轉[18]。在該模型中，mutp53滅活劑PRIMA-1Met與蛋白酶體抑制劑卡非佐米聯合顯示出高效率地降低原發性腫瘤的生長和轉移[18]。

8 小 結

在大部分乳腺癌中，p53的錯義突變導致mutp53蛋白在癌細胞中的累積。大量mutp53失去了野生型p53的腫瘤抑制活性，并與其他轉錄因子或蛋白質形成異常復合物，也可以通過影響乳腺癌細胞細胞質內的動態平衡和染色體的狀態來改變基因表達，最終導致乳腺癌細胞的侵襲性增強，癌細胞生長、轉移。現今乳腺癌相關mutp53蛋白質復合物的列表不斷增加，致癌表型的數量也在不斷增加。mutp53結構去穩定、破壞特定靶蛋白的致癌復合物以及降低mutp53的積累是治療攜帶mutp53的乳腺癌的主要途徑。詳細了解涉及mutp53轉錄和非轉錄的復合物是開發新分子靶向藥物的重要前提，也是現有藥物靶向治療的重要前提。這些藥物可以成為治療攜帶mutp53的乳腺癌的新型治療方案，有利于為患者制定個體化治療方案，預防性地減少乳腺癌的復發和進展。