辣木籽中總黃酮的提取工藝研究

1.中國科學院西雙版納熱帶植物園，云南 西雙版納 666303；2.云南中醫學院，云南 昆明 650500

辣木(Moringaoleifera) 又名洋椿樹、鼓槌樹，為辣木科( Morin gaceae) 辣木屬(Morin ga Adans.) 植物，起源于印度西北部的喜馬拉雅山南麓，是辣木屬中可以食用且利用和研究最多、最有商業價值的品種。我國于20 世紀60 年代初開始在臺灣、海南、廣東、云南南部等廣大熱帶、亞熱帶地區引種辣木。辣木為藥食兩用的植物，其樹葉、花、果莢不僅含有鈣、鉀和氨基酸等營養物質，且在印度和非洲國家常用于退熱、消炎、降壓、強心和抗菌等[1]。目前，國內外學者主要集中于辣木營養學方面的研究[2-3]，辣木的藥用保健功能日益受到人們的重視[4]。

辣木籽作為純天然綠色食品，營養物質含量非常豐富，食用辣木籽可預防疾病、延緩衰老、改善睡眠、增強免疫力和記憶力[5]。經初步分析，辣木籽中含有黃酮類化合物[6]。黃酮類化合物的生理活性比較廣泛，具有清除自由基、抗氧化、抗癌、防癌、治療心血管病、降血糖等作用。近年來對辣木的開發已成熱點，但從辣木籽中提取黃酮類化合物的研究鮮有報道[7]。本文以辣木籽總黃酮轉移率為指標，采用正交試驗方法分別考察微波提取法、回流提取法、超聲提取法中的各種影響因素，旨在提高辣木籽中總黃酮的提取率，并通過對比產生最佳的提取工藝，為辣木籽的進一步開發利用提供了理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV-1800型紫外可見分光光度計(上海翱藝儀器有限公司)；FA2014電子分析天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；JA-20001電子天平(廣州玉治儀器有限公司)； hWC-3型微波提取設備(天水華圓制藥設備科技有限公司)；電熱鼓風干燥箱(北京市光明醫療儀器廠)；DLSB-5/10低溫冷卻液循環泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；S g250 hPT超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)； h h-4數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；BCD-186KB冰箱(青島海爾股份有限公司)；

1.2 材料 辣木籽經云南中醫學院鑒定教研室楊竹雅副教授鑒定為辣木科辣木屬植物辣木的種子；蘆丁標準品(批號：PRF8012042，成都普瑞法科技開發有限公司)；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、三氯化鋁均為分析純；純凈水(昆明娃哈哈啟力飲料有限公司)。

2 方法

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 標準品溶液的制備 精密稱取蘆丁標準品6 m g(105℃常壓干燥至恒重)于25 mL容量瓶中，用適量60%乙醇溶解，定容至刻度線，即為標準品溶液。

2.1.2 標準曲線的制備 分別取蘆丁標準品溶液0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 mL于9個25 mL容量瓶中，各加5%NaNO2溶液1 mL，放置6 min后，加10%A1( NO3)3溶液1 mL，放置6 min，加4%NaOH溶液10 mL，用60%乙醇定容至刻度，搖勻。以不加標準溶液的相應溶液為空白，在510 nm處測定吸光度[8-9]，繪制標準曲線。

2.1.3含量測定 將辣木籽原藥材粉碎，精密稱取5 g置于500 mL圓底燒瓶中，加40 mL60%乙醇回流提取2 h，收集濾液，濾渣加入30 mL60%乙醇回流提取1 h，合并兩次濾液于100 mL容量瓶中，濾渣用60%乙醇洗滌3次，定容。精密量取5 mL溶液按2.2項下顯色方法進行顯色，測定藥材中的總黃酮含量。

2.1.4 供試品溶液的制備 精密稱取0.5 g辣木籽干浸膏于25 mL容量瓶中，加入適量60%乙醇，超聲30 min，用60%乙醇定容至刻度。將溶液離心10 min(轉速5000)，取上清液，即得供試品溶液，備用。按2.2項下顯色方法進行顯色，測定各浸膏中總黃酮的含量。

2.2 正交試驗

2.2.1 正交試驗方法 采用L9(34)正交試驗法，以辣木籽浸膏中總黃酮的轉移率為評價指標。稱取藥材9份，每份50 g，按正交試驗表進行提取[10-12]，每份藥材提取后過濾，合并濾液，濃縮濾液并干燥至干燥浸膏。按3.4項下浸膏的處理方法，進一步測定浸膏中總黃酮的含量并計算其相應的轉移率。

2.2.2 微波提取法正交試驗設計 通過單因素實驗，確定微波提取的功率為10 KW，并確定該提取方法的4個影響因素：提取時間(3 min，5 min，7 min)；乙醇用量(6倍量，8倍量，10倍量)；乙醇濃度(60%，70%，80%)；提取次數(1次，2次，3次)。見表1。

表1 微波提取法正交試驗因素水平

2.2.3 回流提取法正交試驗設計 通過單因素實驗，確定了該提取方法的4個影響因素：提取時間(1 h，1.5 h，2 h)；乙醇用量(6倍量，8倍量，10倍量)；乙醇濃度(60%，70%，80%)；提取次數(1次，2次，3次)。見表2。

表2 回流提取法正交試驗因素水平

2.2.4 超聲提取法正交試驗設計 通過單因素實驗，確定超聲提取的功率為500 W，并確定該提取方法的4個影響因素分別為：提取時間(33 min，45 min，60 min)；乙醇用量(6倍量，8倍量，10倍量)；乙醇濃度(60%，70%，80%)；提取次數(1次，2次，3次)。見表3。

表3超聲提取法正交試驗因素水平

水平因素提取時間(A)乙醇用量(B) 乙醇濃度(C)提取次數(D)130min6倍60%1245min8倍70%2360min10倍80%3

2.3 驗證性實驗 取3份藥材，每份2 kg，按照正交試驗所篩選出的提取工藝進行提取，濾液濃縮并烘干至干浸膏，取適量干浸膏于25 mL容量瓶中，按3.4項下浸膏處理方法將浸膏處理成供試品溶液，取適量供試品溶液按3.2項下黃酮顯色方法進行顯色，測定各份供試品溶液的吸光度，并計算浸膏中總黃酮的轉移率。

3 結果

3.1 藥材總黃酮含量 按上述方法測得辣木籽藥材中總黃酮的含量為0.11%。

3.2 標準曲線 標準曲線方程為A=7.5868C-0.003(R2=0.9993)，結果表明：蘆丁在0.0048～0.0384 mg/mL濃度范圍內線性關系良好。

3.3 正交試驗結果

3.3.1 微波提取法正交試驗結果 通過正交試驗選出微波提取法提取辣木籽藥材中總黃酮的最佳工藝條件。見表4、表5。由表5可見，因素A、B、C、D的P值均<0.05,表明微波提取法中的提取時間、乙醇用量、乙醇濃度、提取次數對辣木籽總黃酮的轉移率的影響均有統計學意義。由表5中方差的大小可知各因素影響的大小順序為D(提取次數)>B(乙醇用量)>A(提取時間)>C(乙醇濃度)。其中，因素A的第1水平最好，因素B的第3水平最好，因素C的第3水平最好，因素D的第2水平最好，因此，最終確定最佳工藝條件為A1B3C3D2，即微波提取時間為3 min，乙醇用量為10倍量，乙醇濃度為80%，提取次數為2次。

表4 微波提取法正交試驗結果

表5 微波提取法正交試驗方差分析

3.3.2 回流提取法正交試驗 通過正交試驗選出回流提取法提取辣木籽藥材中總黃酮的最佳工藝條件。見表6和見表7。由表7可見，因素A、B、C、D的P值均<0.05,表明回流提取法中的提取時間、乙醇用量、乙醇濃度、提取次數對辣木籽總黃酮的轉移率的影響均有統計學意義。由表7中方差的大小可知各因素影響的大小順序為C(乙醇濃度)>D(提取次數)>A(提取時間)>B(乙醇用量) 。其中，因素A的第3水平最好，因素B的第3水平最好，因素C的第2水平最好，因素D的第2水平最好，因此，最終確定最佳工藝條件為A3B3C2D2，即回流提取時間為2 h，乙醇用量為10倍量，乙醇濃度為70%，提取次數為2次。

表6 回流提取法正交試驗結果

表7 回流提取法正交試驗方差分析

3.3.3 超聲提取法正交試驗 通過正交試驗選出超聲提取法提取辣木籽藥材中總黃酮的最佳工藝條件。見表8和表9。由表9可見，P<0.05表明超聲提取法中的提取次數對辣木籽總黃酮的轉移率有顯著影響,而 PA、PB、PC>0.05,表明提取時間、乙醇用量、乙醇濃度對辣木籽總黃酮的轉移率的影響不顯著。由表9中方差的大小可知各因素影響的大小順序為D(提取次數)> C(乙醇濃度)>A(提取時間)>B(乙醇用量) 。其中，因素A的第3水平最好，因素B的第2水平最好，因素C的第2水平最好，因素D的第2水平最好，因此，最終確定最最佳工藝條件為A3B2C2D2，即超聲提取時間為60 min，乙醇用量為8倍量，乙醇濃度為70%，提取次數為2次。

表8 超聲提取法正交試驗結果

表9 超聲提取法正交試驗方差分析

3.4 3種提取方法比較 通過對比3種提取方法發現，微波提取法和回流提取法的轉移率與超聲提取法的轉移率相比顯著偏高(P<0.05)，微波提取法的轉移率與回流提取法的轉移率相比無顯著差異(P>0.05)，故為提高辣木籽中總黃酮的轉移率、簡化提取步驟、縮短實驗時間，確定最佳提取條件為：微波提取法提取2次，每次3 min，溶劑為10倍量的80%乙醇。

3.5 驗證性實驗 由表10可知，在最佳工藝條件下，最后所得辣木籽浸膏中總黃酮的轉移率為93.89%。

表10 驗證性實驗結果

4 分析與討論

分光光度法測定黃酮含量的常用方法有Al(NO3)3法和AlCl3法[13]，為了選擇合適的測定方法，在正式實驗前進行了預實驗，結果顯示Al(NO3)3法比AlCl3法具有更高的穩定性、重復性和準確度，故選擇Al(NO3)3法在510 nm處測定吸光度，從而計算供試品溶液中總黃酮的含量。

測定辣木籽中總黃酮的含量時，首先對提取方式進行單因素實驗，考察回流提取法、微波提取法以及超聲提取法這3種提取方法對辣木籽總黃酮的提取效率。結果顯示，回流提取法具有最高的提取效率；微波提取法的提取效率較低可能由于含量測定時所取藥材的量較少，在微波提取設備中浪費嚴重，導致含量測定誤差較大；超聲提取法的提取效率最低可能是由于提取溫度或超聲儀的頻率較低，導致黃酮類化合物不易溶出。選用回流提取法測定總黃酮含量時，比較了藥材脫脂與不脫脂兩種方法的提取效率，結果顯示兩種方法之間不存在顯著性差異，可能是因為油脂類成分在Al(NO3)3顯色條件下不發生顯色反應，在510 nm處不吸收紫外光。

本文前期通過單因素實驗，分別確定了微波提取法、回流提取法和超聲提取法中各因素的水平范圍，后分別對3種方法進行了正交試驗。對各提取方式的正交試驗進行重復實驗時，部分組別的3次數據之間誤差較大，導致這一誤差的原因可能是：一是提取過程中濾渣損耗較大或濾液在轉移過程中浪費嚴重；二是供試品處理過程中，供試品溶液在離心之后上清液依然含有少量懸浮物，導致測定供試品吸光度時存在較大差異；三是供試品溶液在測定吸光度前放置時間較長，穩定性下降，導致吸光度數據不穩定。

根據實驗結果，本實驗優選的最佳工藝為微波提取法提取2次，每次3 min，溶劑為10倍量的80%乙醇。驗證實驗結果表明，總黃酮的提取率都得到了提高，說明所選的工藝是穩定而有效的，為辣木籽的進一步研究開發提供了科學依據。