HPLC法測定鱉甲消痔膠囊中沒食子酸的含量

云南省曲靖市食品藥品檢驗檢測中心，云南 曲靖 655000

鱉甲消痔膠囊由地榆、地瓜藤、黃柏、土大黃、鱉甲、槐角、忍冬藤、梔子八味中藥配伍而成，具有清熱解毒、涼血止血、消腫止痛的功效。用于濕熱蘊結所致的內痔出血、外痔腫痛、肛周瘙癢。文獻查詢發現，目前對該制劑的研究主要有：用TLC法對大黃、地榆、槐角、梔子進行鑒別；用高效液相色譜法測定制劑中鹽酸小檗堿的含量[1-2]。為了進一步研究該制劑，筆者選取該制劑中一種臣藥地榆，建立HPLC法測定地榆中沒食子酸的含量。地榆屬薔薇科植物，采挖后除去須根，洗凈，干燥，或趁鮮切片，干燥。具有涼血止血、解毒斂瘡之功效，用于便血、痔血、血痢、崩漏、癰腫瘡毒等癥。有文獻[3-4]對地榆的抗炎抑菌作用進行了研究，研究表明地榆對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草桿菌、變形桿菌，甲型鏈球菌等細菌具有很好抑制作用。地榆中化學成分主要為鞣質類、三萜皂苷類、黃酮類[5]，其中鞣質類化合物是地榆的主要有效成分，沒食子酸是鞣質的重要組成成分，也是評價地榆質量的主要指標[6]。沒食子酸是自然界中廣泛存在的一種多酚類化合物。有研究表明，沒食子酸具有止血、抗炎、抗突變、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、殺錐蟲等多種生物活性[7-8]。有研究證實沒食子酸體外對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌有一定的抑菌作用[9-10]。本實驗建立高效液相色譜法測定鱉甲消痔膠囊中沒食子酸含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 AgiLent1260高效液相色譜儀(配置四元泵、自動進樣器、UV檢測器)；ThermoC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；XS105電子分析天平(梅特勒上海公司)。

1.2 試藥 沒食子酸(90.1%，批號：110831-200803，中國食品藥品檢定研究院)。鱉甲消痔膠囊(批號：1511014、1511038、2576004，貴州漢方藥業有限公司)。流動相用試劑為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件色譜柱：ThermoC18(250×4.6 mm，5 μm；流動相：流動相0.025%磷酸-甲醇(95.5∶4.5)；流速1.0 mL/min；檢測波長272 nm；柱溫25℃；進樣量：5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸10.34 mg置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得質量濃度為0.1863 mg/mL沒食子酸儲備液。精密吸取沒食子酸儲備液5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得沒食子酸對照品使用液。

2.2.2 供試品溶液制備 取鱉甲消痔膠囊20粒，精密稱定,混勻，取約0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10%鹽酸溶液10 mL，振搖，加入30 mL純化水，搖勻，置于電爐上煮沸20 min，取下，冷卻至室溫，過濾，收集濾液置于50 mL容量瓶中。用水洗滌濾渣，合并濾液于50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品制備 按處方各藥材比例及制法，制得不含地榆的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3 系統適用性試驗 分別取供試品溶液、對照品溶液，按上述色譜條件實驗，對系統適用參數進行考察，沒食子酸理論板數為6893。理論板數大于2000[1]。

2.4 線性關系考察 分別精密吸取2.2.1項下的沒食子酸對照品使用液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度；搖勻，即得系列質量濃度的對照品溶液。在2.1項下的色譜條件下測定。以沒食子酸濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，經線性回歸，回歸方程為Y=17.0217X-3.6469，r=1.0000。結果表明：沒食子酸在0.9316～46.58 μg/mL范圍內具有良好的線性關系。對照品、供試品、陰性對照的色譜圖見圖1。

2.5 精密度試驗 取同一濃度的對照品溶液，在2.1項色譜條件下連續進樣測定6次，記錄沒食子酸峰面積，其RSD為0.8%(n=6)。

2.6 穩定性試驗 取同一在2.2.2項下制備的樣品，在2.1項下色譜條件下分別于2、4、8、16、24 h進樣5 μL，記錄峰面積，結果測得沒食子酸峰面積RSD為0.8%。表明樣品在24 h穩定。

2.7 重復性試驗 取同一批號樣品(批號:2576004)，按照2.2.2項下方法制備6份供試品溶液，在2.1項色譜條件下測定，測得沒食子酸含有量RSD為1.2%(n=6)。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的鱉甲消痔膠囊(批號2576004)6份，每份約0.4 g,置具塞錐形瓶中，分別精密加入濃度為0.4209 mg/mL的沒食子酸對照品溶液2.5 mL，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，計算回收率，結果見表1。

表1 回收率試驗結果 (n=6)

2.9 樣品測定結果 取鱉甲消痔膠囊20粒，精密稱定，混勻，取約0.8 g，精密稱定，平行3份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，在2.1項下的色譜條件下測定，計算含有量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果(mg/粒，n=3)

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 取沒食子酸對照品溶液在200～400 nm范圍內進行紫外掃描，沒食子酸在272 nm處有最大吸收，與中國藥典地榆含量測定項下選用波長一致，故選擇272 nm為檢測波長。

3.2 流動相的選擇 首先嘗試了甲醇和水做流動相，經進樣檢測，結果峰型不好，然后參考中國藥典[1]地榆含量項下流動相甲醇-0.05%磷酸溶液(5∶95)，發現峰型變好，但目標峰與相鄰的雜峰分離不是很好，而且雜峰較多，查閱相關文獻[11-13]，改變磷酸溶液濃度為0.025%，發現峰型變好，分離度符合要求，故選擇0.025%磷酸-甲醇(4.5∶95.5)作為流動相。

3.3 提取方式的選擇 通過參考中國藥典[1]和文獻[14-15]，嘗試用水和不同濃度(30%、50%、70%)的乙醇作為提取溶劑，煮沸和回流兩種提取方式，提取時間(10 min、20 min、30 min、40 min)。結果用水做溶劑通過煮沸含量較高，三種不同濃度乙醇回流含量無明顯差異且比水煮沸含量低。提取時間20 min、30 min、40 min含量無明顯變化。但同時發現以上幾種提取出的供試品中目標峰型較差，而且雜峰多，查閱相關文獻[16-17]了解到PH對沒食子酸穩定性影響較大，沒食子酸在酸性條件下穩定，隨PH值增加穩定性逐漸下降，堿性條件下極不穩定。嘗試加入不同濃度(2%、5%、10%、15%)的鹽酸溶液。鹽酸溶液加入體積有5、10 mL兩種。結果發現加入10%鹽酸溶液10 mL,沒食子酸含量測定值最高且與加入15%鹽酸溶液10 mL無明顯差異。綜合以上實驗，確定了本法的提取方式。