吲哚布芬四氫異喹啉衍生物的設計、合成及生物活性研究

湯 泉，張榮泉，王 杰，張 暉，張恩立

(蚌埠醫(yī)學院公共基礎學院，安徽蚌埠 233030)

心腦血管疾病是一類嚴重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病。據(jù)報道，我國2014年農(nóng)村和城鎮(zhèn)心腦血管疾病死亡率高達295.6/10萬人和262.0/10萬人[1]。研究顯示，心腦血管疾病的發(fā)病與血栓形成有著密切關(guān)系，而血小板聚集是導致血栓形成的主要原因之一[2]。因此，研發(fā)新型的抗血小板聚集藥物對治療心腦血管疾病具有重要意義。

吲哚布芬(圖1(a))是一種通過抑制環(huán)氧化酶達到抗血小板聚集的非類固醇類藥物，可用于治療血栓栓塞、卒中及心肌梗死，但其對胃腸道具有一定的刺激作用及存在出血風險[3-4]。因此通過對吲哚布芬結(jié)構(gòu)進行修飾，研發(fā)高效低毒的吲哚布芬衍生物備受關(guān)注。李豐[5]等通過拼合原理，設計合成了3個吲哚布芬酯類化合物，后期其藥理活性顯示，化合物吲哚布芬川芎嗪酯(圖1(b))具有較好的抗血小板聚集活性。

我國中藥資源豐富，以中藥小分子為模型化合物，研發(fā)新型抗血小板藥物已成為藥物研發(fā)領(lǐng)域的重點之一。四氫異喹啉類生物堿廣泛分布于自然界罌粟科、馬兜鈴科等植物中。近代藥理學研究表明，該類生物堿具有較好的抗血小板聚集、抗腫瘤等生物活性[6]。謝迪[7]等設計合成了15個新型川芎嗪四氫異喹啉類化合物，其中化合物7o(圖1(c))對ADP誘導的血小板聚集活性優(yōu)于奧扎格雷鈉。另外，Yang[8]等研究顯示，1-鄰氯苯基-1,2,3,4-四氫異喹啉衍生物(圖1(d))對ADP誘導的血小板聚集也具有較好的活性。綜上，四氫異喹啉類化合物在抗血小板聚集研究中具有較高的研究價值。

基于以上基礎，本文認為吲哚布芬與四氫異喹啉骨架拼合物可能具有更好的抗血小板聚集活性，同時可以降低吲哚布芬結(jié)構(gòu)中羧基對胃腸道的刺激。因此，本文依據(jù)拼合原理，設計合成了3個吲哚布芬四氫異喹啉衍生物，并對其體外抗血小板聚集活性進行了初步篩選，合成路線及3個合成化合物結(jié)構(gòu)見圖2。

圖1 化合物吲哚布芬、吲哚布芬川芎嗪酯、7o和1-鄰氯苯基-1,2,3,4-四氫異喹啉衍生物結(jié)構(gòu)

圖2 Scheme吲哚布芬四氫異喹啉衍生物的合成路線

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

R-1020旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)、HWCL-5恒溫集熱式磁力攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)、FA1204B電子天平(上海精密儀器儀表有限公司)、SGW X-4型顯微熔點儀(上海精密科學儀器有限公司)、LCQ ADVANTAGE MAX液質(zhì)連用質(zhì)譜儀(FINNIGAN公司)、Bruker 400 MHz超導核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標)。

3,4-二甲氧基苯甲醛、4-硝基苯甲醛、4-甲基苯甲醛、3,4-二甲氧基苯乙胺、吲哚布芬均購自上海卓銳化工有限公司；二氯甲烷、三乙胺、甲醇、甲苯等試劑均為市售分析純，均購自合肥寶添科貿(mào)有限公司；薄層和柱層析用硅膠購自合肥中皖化學試劑有限公司。

1.2 合成方法

1.2.1 化合物6a的制備[9]

將甲苯50 mL、4-甲基苯甲酸(4 g,29.4 mmol)、SOCl220 mL依次加入一裝有回流裝置的150 mL圓底燒瓶中，加熱升溫至75℃攪拌反應4 h，TLC[V(氯仿)∶V(甲醇)=5∶1]檢測反應完全，減壓蒸除甲苯和SOCl2，用無水甲苯帶蒸3次(30 mL/次)，得化合物2a，用20 mL CH2Cl2溶解備用。

將CH2Cl260 mL、3,4-二甲氧基苯乙胺(5.3 g,29.3 mmol)、三乙胺6 mL依次加入一150 mL圓底燒瓶中，冰浴條件下，將用CH2Cl2溶解的化合物2a通過恒壓滴液管緩慢加入，滴完后，撤去冰浴，常溫繼續(xù)反應2.5 h，TLC[V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=2∶1]檢測反應完全，分別用HCl(3 mol·L-1)、NaOH(1 mol·L-1)飽和NaCl各洗滌3次，每次洗滌用HCl 50 mL、NaOH 80 mL和飽和NaCl 60 mL，洗滌后用無水硫酸鈉干燥，抽濾，旋蒸濃縮，無水CH3CH2OH重結(jié)晶，抽濾，干燥，得灰色固體4a(7.1 g)，收率81.1%。

將甲苯50 mL、4a(3.0 g,10.0 mmol)依次加入一150 mL三頸燒瓶中，升溫至85℃，攪拌條件下，通過恒壓滴液漏斗緩慢加入POCl3(7.0 mL,24.2 mmol)，滴加完畢后，升溫至115℃反應7 h，TLC[V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=2∶1]檢測反應完全，蒸除甲苯和過量POCl3，用乙酸乙酯60 mL稀釋，轉(zhuǎn)移到分液漏斗，加水提取3次(50 mL/次)，合并水層，在冰浴條件下用濃氨水調(diào)pH，使pH為9～10，靜置10 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，用CH2Cl2提取3次(50 mL/次)，用飽和NaCl洗滌合并后的CH2Cl23次(60 mL/次)，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸除CH2Cl2，得黃色油狀物5a(2.4 g)，收率85.2%。

用無水甲醇40 mL將化合物5a(2.4 g,8.5 mmol)溶解，在冰浴攪拌條件下，分批將NaBH4(0.4 g,19.2 mmol)加入，撤去冰浴，常溫反應4 h，TLC[V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=2∶1]檢測反應完全，減壓蒸除甲醇，用CH2Cl230 mL溶解，加入50 mL水，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，取CH2Cl2層，繼續(xù)用水洗滌2次(50 mL/次)，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸除CH2Cl2，甲醇重結(jié)晶，得白色固體6a(1.8 g)，收率75.0%。

1.2.2 化合物8a(2-(4-(1,(6-,7-二甲氧基-1-(對甲苯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1H)-基)-1-氧代丁基-2-基)苯基)異吲哚啉-1-酮)的制備用制備化合物2a的方法合成化合物7，此步所投原料吲哚布芬1g(3.4 mmol)，化合物7用30 mL CH2Cl2溶解備用。

將CH2Cl250 mL、6a(1.0 g,3.5 mmol)、三乙胺4 mL依次加入一150 mL圓底燒瓶中，冰浴條件下，將用CH2Cl2溶解的化合物7通過恒壓滴液管緩慢加入，滴完后，撤去冰浴，常溫繼續(xù)反應2.5 h，TLC[V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=10∶1]檢測反應完全，分別用HCl(3 mol·L-1)、飽和Na2CO3、飽和NaCl各洗滌3次，每次洗滌用HCl 40 mL、飽和Na2CO350 mL和飽和NaCl 50 mL，無水硫酸鈉干燥，濃縮，過硅膠柱，得白色固體8a(1.2 g)，產(chǎn)率60.6%。m.p.144.3～144.9℃;1H NMR(400MHz，CDCl3)δ∶7.83(d，J=7.2 Hz,1H,PhH),7.76(d,J=8.8 Hz,1H,PhH),7.70(d,J=8.8 Hz,1H,PhH),7.50(t,J=8.4 Hz,1H,PhH),7.43(d,J=7.6 Hz,2H,PhH),7.27～7.22(m,1H,PhH),7.08(d,J=8.4 Hz,1H,PhH),7.02(d,J=8.4 Hz,1H,PhH),6.98(d,J=6.8 Hz,1H,PhH),6.94(d,J=6.8 Hz,1H,PhH),6.82(s,1H,PhH),6.58(s,1H,PhH),6.50(s,1H,NCH),6.40(d,J=7.2 Hz,1H,PhH),4.74(t,J=2.8 Hz,2H,NCH2),3.80(s,3H,OCH3),3.69(s,3H,OCH3),3.36～3.18(m,1H,NCH2CH2),3.08～3.01(m,1H,NCH2CH2),2.90～2.85(m,1H,COCH),2.25(s,3H,PhCH3),2.18～2.06(m,2H,CH2CH2),1.74～1.68(m,2H,CHCH2CH3),0.85～0.79(m,3H,CH2CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ∶170.3,166.5,147.0,146.8,146.5,146.4,139.0,138.4,137.1,136.1,135.8,135.3,132.1,131.1,127.8,127.4,126.4,126.0,125.7,125.4,123.1,121.6,118.6,118.4,110.4,110.1,54.9,53.6,53.4,49.7,38.2,27.8,27.3,20.0,11.5．ESI-Mass:m/z 561.00(M++H)。

參照化合物8a合成方法合成目標化合物8b和8c。

8b：(2-(4-(1,(6-,7-二甲氧基-1-(對硝基苯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1H)-基)-1-氧代丁基-2-基)苯基)異吲哚啉-1-酮)，淡黃色固體，產(chǎn)率65.2%，m.p.151.2～151.7℃;1H NMR(400MHz，CDCl3)δ∶8.07(d，J=8.8 Hz,1H,PhH),7.97(d,J=8.8 Hz,1H,PhH),7.83(d,J=7.6Hz,1H,PhH),7.78(d,J=8.4 Hz,1H,PhH),7.72(d,J=8.8 Hz,1H,PhH),7.52(t,J=7.6 Hz,1H,PhH),7.44(t,J=7.2 Hz,2H,PhH),7.39(d,J=8.8 Hz,1H,PhH),7.29～7.23(m,2H,PhH),7.21(d,J=8.0 Hz,1H,PhH),6.84(s,1H,PhH),6.61(s,1H,PhH),6.47(s,1H,NCH),4.76(t,J=4.4Hz,2H,NCH2),3.82(s,3H,OCH3),3.71(s,3H,OCH3),3.65～3.54(m,1H,NCH2CH2),3.06～3.00(m,1H,NCH2CH2),2.91～2.85(m,1H,COCH),2.64～2.59(m,1H,CH2CH2),2.11～2.08(m,1H,CH2CH2),1.75～1.69(m,2H,CHCH2CH3),0.84～0.80(m,3H,CH2CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ∶171.0,166.6,149.1,148.6,147.6,146.9,146.7,146.0,139.0,137.4,134.6,132.0,131.2,128.6,128.2,127.6,127.4,127.3,125.6,124.8,123.1,122.5,122.4,121.7,118.7,110.3,55.0,53.6,49.7,49.5,38.8,27.6,27.1,11.4．ESI-Mass:m/z 592.04(M++H)。

8c：(2-(4-(1,(6-,7-二甲氧基-1-(4,5-二甲氧基苯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1H)-基)-1-氧代丁基-2-基)苯基)異吲哚啉-1-酮)，白色固體，產(chǎn)率73.8%，m.p.164.5～165.2℃;1H NMR(400MHz，CDCl3)δ∶7.83(s,1H,PhH),7.76(d,J=6.4 Hz,1H,PhH),7.69(d,J=6.8Hz,1H,PhH),7.51(s,1H,PhH),7.42(t,J=6.0 Hz,2H,PhH),7.26(t,J=5.6 Hz,2H,PhH),6.87(s,1H,PhH),6.83(d,J=7.6 Hz,1H,PhH),6.66(d,J=8.0 Hz,1H,PhH),6.59(s,1H,NCH),6.56～6.48(m,1H,PhH),6.42～6.35(m,1H,PhH),4.76(t,J=2.8 Hz,2H,NCH2),3.82(s,3H,OCH3),3.77(s,3H,OCH3),3.71(s,3H,OCH3),3.67(s,3H,OCH3),3.25～3.21(m,1H,NCH2CH2),3.07～3.01(m,1H,NCH2CH2),2.65～2.61(m,1H,COCH),2.37～2.33(m,1H,CH2CH2),2.12～2.10(m,1H,CH2CH2),1.73～1.70(m,2H,CHCH2CH3),0.84～0.82(m,3H,CH2CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ∶170.4,166.5,147.8,147.0,146.5,139.0,137.2,135.2,134.1,132.1,131.1,127.6,127.4,127.3,126.1,125.5,123.1,121.6,120.1,119.8,118.6,118.5,110.6,110.4,110.1,109.1,55.0,54.8,53.5,49.7,49.3,38.1,27.9,27.3,11.5．ESI-Mass:m/z607.07(M++H) 。

1.3 藥理實驗[10]

本文以阿司匹林為陽性對照藥，采用Born比濁法測試吲哚布芬四氫異喹啉衍生物的體外抗血小板聚集活性。選取新西蘭雄性家兔，體重1.8～2.2 kg，枸櫞酸鈉與10 mL生理鹽水配制成3.8%的枸櫞酸鈉溶液，用1%鹽酸普魯卡因?qū)彝眠M行局部麻醉，頸動脈插管放血，和枸櫞酸鈉溶液以9∶1混合，以800～1000 r·min-1離心10 min，取富血小板血漿(PRP)，剩余部分以3000 r·min-1離心，取貧血小板血漿(PPP)，聚集誘導劑用10 ug·mL-1的二磷酸腺苷(ADP)、10 ug·mL-1的花生四烯酸(AA)。每管280 uL PRP中加入不同濃度的藥物(吲哚布芬四氫異喹啉衍生物均用DMSO溶解，加純凈水稀釋至所需濃度分別為0.8 ug·mL-1、4 ug·mL-1、20 ug·mL-1、100 ug·mL-1、500 ug·mL-1，阿司匹林用DMSO溶解，加純凈水稀釋至與哚布芬四氫異喹啉衍生物相同濃度)10 uL，對照組PRP中加入生理鹽水10 uL，37℃溫浴3 min，然后加入上述誘導劑，用LG-PABER-1型血小板聚集儀檢測血小板聚集率，并計算IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

通過氯化反應、酰胺化反應、Bischler-Napieralski反應等步驟合成了所設計的3吲哚布芬四氫異喹啉衍生物，其結(jié)構(gòu)均經(jīng)核磁和質(zhì)譜確證，詳細結(jié)構(gòu)見圖2。

采用Born比濁法測試了吲哚布芬四氫異喹啉衍生物的體外抗血小板聚集活性，結(jié)果見表1。

表1 化合物8a-8c及阿司匹林對AA和ADP誘導的血小板聚集抑制活性

2.2 討論

化合物4a經(jīng)Bischler-Napieralski反應得化合物5a，反應過程中需升溫至80～85℃后再將三氯氧磷緩慢加入，然后升溫至115℃反應，為最佳反應條件，如果在低于80℃或高于85℃時將三氯氧磷加入，反應過程中產(chǎn)生黑色粘稠狀物質(zhì)，導致5a產(chǎn)率極低。在加入硼氫化鈉時，需分批緩慢加入，以防液體濺出。

通過Born比濁法測試了吲哚布芬四氫異喹啉衍生物的體外抗血小板聚集活性，結(jié)果顯示，3個合成化合物均具有一定的抗血小板聚集活性，其中化合物8b、8c對AA誘導的血小板聚集抑制活性優(yōu)于阿司匹林，同時8b對ADP誘導的血小板聚集抑制活性也優(yōu)于阿司匹林，可能在B苯環(huán)上引入吸電子基團會增加該類化合物的體外抗血小板聚集活性，有待進一步研究。