環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在細(xì)菌性腸道傳染病診斷中的應(yīng)用研究進(jìn)展

張維強(qiáng)，張楊

天津市第一中心醫(yī)院 (天津 300192)

腸道傳染病的發(fā)生多與細(xì)菌、病毒、寄生蟲等有關(guān)，主要以消化道癥狀為主，具有起病急、傳染性強(qiáng)、傳播快、危害大等特點(diǎn)，通常在人群密集的食堂、飯店等場所暴發(fā)及流行[1]。細(xì)菌性腸道傳染病主要包括霍亂、細(xì)菌性痢疾、傷寒及其他感染性腹瀉疾病等，若不及時采取治療措施，將引起嚴(yán)重并發(fā)癥，甚至造成患者死亡[2]。因此，尋求操作簡單、成本低、高效的腸道傳染病檢測技術(shù)在病情控制中十分關(guān)鍵。現(xiàn)就環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)的原理、特點(diǎn)及相關(guān)腸道傳染病的研究進(jìn)展展開以下綜述。

1 LAMP技術(shù)原理及特點(diǎn)

LAMP最早是由日本學(xué)者發(fā)明，被稱為新型體外擴(kuò)增核酸片段分子生物學(xué)技術(shù)，即LAMP技術(shù)。LAMP技術(shù)的作用原理是將靶基因的6個區(qū)域設(shè)計(jì)為4種特異引物，并根據(jù)鏈置換反應(yīng)，于60～65 ℃下孵育1 h，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行判定，明確是否有目標(biāo)基因的存在，擴(kuò)增DNA時需依靠DNA聚合酶，而擴(kuò)增RNA時僅需加入反轉(zhuǎn)錄酶；2002年有學(xué)者在LAMP反應(yīng)體系中又加入2條環(huán)引物，進(jìn)而加快了反應(yīng)速度，且使檢測效果得到提升[3]。LAMP技術(shù)無須特殊、精密的儀器及嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，具有操作簡單、成本低、高靈敏度、高特異度等特點(diǎn)。

2 LAMP技術(shù)在細(xì)菌性腸道傳染病診斷中的應(yīng)用

2.1 霍亂

霍亂弧菌屬于革蘭陰性菌，被歸為甲類傳染病，其發(fā)生具有傳播迅速、病死率高、危害大等特點(diǎn)。因此，如何早期對霍亂做出準(zhǔn)確診斷，在疫情控制中具有重要意義。姚文山等[4]研究中為建立LAMP檢測，對霍亂弧菌毒素基因(ctxA)設(shè)計(jì)了4條引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LAMP對細(xì)菌培養(yǎng)物的檢測靈敏度為10 CFU/ml，對魚肉模擬樣品檢測靈敏度為102 CFU/ml，且在16份實(shí)際樣品中檢測出4份ctxA基因陽性，表明建立LAMP方法具有較高的靈敏度及特異度，可快速檢測出食品中的霍亂弧菌。相興偉等[5]研究中建立LAMP技術(shù)對水產(chǎn)品中的霍亂弧菌及副溶血性弧菌進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LAMP技術(shù)檢測霍亂弧菌及副溶血性弧菌的靈敏度為3.12 fg，特異度為100%；對模擬食品樣品檢測時檢測限為50 CFU/ml，對60份水產(chǎn)樣品檢測，其中6份出現(xiàn)LAMP陽性，結(jié)果表明，建立LAMP技術(shù)在霍亂弧菌及副溶血性弧菌的檢測中靈敏度及特異度均較高，適用于霍亂弧菌及副溶血性弧菌的快速檢測。

2.2 細(xì)菌性痢疾

細(xì)菌性痢疾的主要病原菌是志賀菌，是引起食物中毒的常見菌種，其中乳制品、肉類等富含蛋白質(zhì)的食物是引發(fā)食物中毒的常見食品。陳傳等[6]研究中建立LAMP技術(shù)對食物中的志賀菌進(jìn)行檢測，針對志賀菌侵襲性質(zhì)粒抗原ipaH基因的6個區(qū)域設(shè)計(jì)了6條引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，13例標(biāo)準(zhǔn)菌中僅有痢疾志賀菌LAMP產(chǎn)物混濁，且將痢疾志賀菌稀釋106倍后仍可被LAMP技術(shù)檢出，而普通技術(shù)無法檢出，結(jié)果表明LAMP技術(shù)可準(zhǔn)確、快速檢出志賀菌，且特異度、靈敏度高。王偉等[7]研究中為建立LAMP技術(shù)檢測，應(yīng)用Primer Explorer V5軟件設(shè)計(jì)針對志賀菌的保守區(qū)引物，對760例門診腹瀉患者糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LAMP檢測技術(shù)具有較高的特異度及靈敏度，且其操作快速，無須特殊儀器，可在基層疾病醫(yī)療機(jī)構(gòu)志賀菌的檢測中廣泛應(yīng)用。

2.3 傷寒與副傷寒

傷寒與副傷寒屬于乙類傳染病，前者由傷寒沙門菌引起，后者由甲、乙、丙型副傷寒沙門菌引起，其引起的急性腸道傳染病已成為主要的公共衛(wèi)生問題。樊粉霞等[8]研究中為建立反轉(zhuǎn)錄LAMP技術(shù)，對傷寒沙門菌STY3671基因設(shè)計(jì)了6條特異度引物，研究發(fā)現(xiàn)134株傷寒沙門菌均呈現(xiàn)陽性，其余47種菌株擴(kuò)張呈現(xiàn)陰性，在全血模擬樣品檢測中靈敏度為7 CFU/ml，明顯高于常規(guī)檢測方法，結(jié)果表明LAMP技術(shù)在傷寒沙門菌的檢測中具有較高的靈敏度及特異度，為傷寒的早期診斷及預(yù)防提供依據(jù)。王鳴柳等[9]研究中為建立LAMP檢測體系，對甲型副傷寒沙門菌特異保守hsdM基因設(shè)計(jì)引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)130株甲型副傷寒沙門菌均呈陽性，其他非甲型傷寒沙門菌均經(jīng)擴(kuò)增呈陰性，在全血模擬樣品檢測中靈敏度為80 CFU/ml，高于普通檢測技術(shù)；對糞便模擬樣本檢測中，對原始樣品檢測下限為500 CFU/g，增菌后檢測下限為0.8 CFU/g，明顯高于普通檢測技術(shù)，結(jié)果表明，甲型副傷寒沙門菌的LAMP檢測具有較高的靈敏度及特異度，可用于甲型副傷寒的早期診斷。

2.4 其他感染性腹瀉

2.4.1致瀉性大腸桿菌

致瀉性大腸桿菌主要指由大腸桿菌內(nèi)一部分可能引起腹瀉的血清型引發(fā)的腸道感染，臨床上常將大腸桿菌分為腸致病性、腸侵襲性、腸出血性、腸產(chǎn)毒性及腸聚集性黏附5種類型，該疾病多發(fā)于兒童及老年群體，尤其以腸出血性大腸桿菌危害最大，通常患者臨床癥狀先為水樣便，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)檠愿篂a，隨著病情發(fā)展，還將引發(fā)溶血性尿毒癥等并發(fā)癥，甚至造成患者死亡。任春陽和田杰[10]研究中為建立LAMP技術(shù)檢測，對大腸埃希菌的lacZ基因序列設(shè)計(jì)了4條特異引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LAMP檢測，300份陽性血培養(yǎng)瓶中有68株大腸埃希菌，其靈敏度及特異度均為100%，且與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，LAMP的檢出時間更短，表明LAMP技術(shù)用于大腸埃希菌的檢測具有快速、成本低、靈敏度及特異度高等優(yōu)勢；蔡樹東等[11]研究中為建立LAMP檢測，對大腸埃希菌ETT2毒力島保守基因ECs3703和HPI毒力島的保守基因irp2分別設(shè)計(jì)了一套引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對大腸埃希菌ETT2及HPI毒力島的檢測限均為100 fg，明顯高于常規(guī)檢測，且對8株非大腸埃希菌擴(kuò)增均呈現(xiàn)陰性，結(jié)果表明LAMP技術(shù)在大腸埃希菌ETT2及HPI毒力島的檢測中均較快速，可將其應(yīng)用于疫病診斷中。

2.4.2沙門菌

沙門菌屬于腸桿菌科，且屬于食源性致病菌，是引起食物中毒的常見菌種。李迎曉等[12]研究中為建立LAMP檢測技術(shù)，對沙門菌屬fimY基因序列設(shè)計(jì)引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30份疑似沙門菌樣本經(jīng)LAMP檢測有21份呈現(xiàn)陽性，且其可檢出的最低濃度為5.6×102CFU/ml，結(jié)果表明LAMP是一種具有較強(qiáng)靈敏度及特異度的檢測技術(shù)。賈艷艷等[13]研究中為建立LAMP快速檢測方法，對沙門菌屬hisJ基因序列設(shè)計(jì)引物，分別選取鼠傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌、雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、傷寒沙門菌及其他6種食源性沙門菌進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其靈敏度為102 CFU/ml，明顯高于常規(guī)檢測方法，特異度結(jié)果顯示僅沙門菌擴(kuò)增結(jié)果呈現(xiàn)陽性，結(jié)果表明LAMP在沙門菌hisJ基因檢測中具有較高靈敏度及特異度，可用于食品沙門菌檢測。

2.4.3空腸彎曲菌

空腸彎曲菌屬于食源性病原菌，其主要傳播途徑包括乳制品、生禽肉、水源等，其宿主為家禽，該疾病多發(fā)于兒童，是引起食物中毒及格林-巴利綜合征的主要病菌。齊詩蕊等[14]研究中為建立LAMP檢測，對空腸彎曲桿菌馬尿酸酶基因(hip O基因)設(shè)計(jì)了6套特異度引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LAMP技術(shù)最低檢出限為6.97×102copies/μl，靈敏度明顯高于常規(guī)檢測，結(jié)果表明LAMP可用于空腸彎曲菌的檢測，且具有較高靈敏度及特異度，適用于現(xiàn)場、基層檢疫及醫(yī)療機(jī)構(gòu)。許紫建等[15]研究中為建立LAMP檢測，對空腸彎曲菌mapA基因序列設(shè)計(jì)引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對其他13種革蘭陰性及陽性菌擴(kuò)增均呈現(xiàn)陰性，對空腸彎曲菌DNA每個反應(yīng)管檢測限為100 fg，對空腸彎曲菌培養(yǎng)菌每個反應(yīng)管檢測限為7.5 CFU，結(jié)果表明LAMP可應(yīng)用于動物源性空腸彎曲菌測定。

3 小結(jié)

LAMP技術(shù)具有操作簡單、檢測迅速、成本低且無須依賴精密儀器等優(yōu)勢，且可在疫情現(xiàn)場、基層醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室、一線疾控部門等廣泛應(yīng)用，為細(xì)菌性腸道傳染病的快速診斷提供技術(shù)支持。但LAMP技術(shù)檢測靈敏度及特異度高與引物的選擇及設(shè)計(jì)密切相關(guān)，臨床應(yīng)用時應(yīng)對引物嚴(yán)格要求，采取大量試驗(yàn)對其反應(yīng)體系及引物檢驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，以確保檢測的有效性。