miR-27a與糖尿病腎病發病機制的研究進展

張馨心，楊 敏,白彝華

(昆明醫科大學第二附屬醫院腎臟內科，昆明 650101)

糖尿病是目前世界上患病率增長最快的代謝紊亂性疾病之一，截至2013年，世界范圍內約有糖尿病患者3.82億，預計到2035年會上升至5.92億[1]。世界上每年因糖尿病相關性疾病死亡的人數多達320萬[2]。糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)在臨床上主要表現為高血壓、持續性蛋白尿、進行性腎功能損害、心血管疾病的發病率及病死率增加等，是糖尿病微血管并發癥之一，也是終末期腎病最常見的原因。DKD的主要病理特點是足突融合、系膜細胞增殖肥大、細胞外基質(extracellular matrix,ECM)蓄積和基膜增厚，最終形成結節狀硬化(Kimmelstiel-wilson結節)，伴腎小管肥大、小管基膜增厚和間質纖維化。足細胞數量減少及凋亡也預示著DKD的進展[3]。

微RNA(microRNA,miRNA)是內源性單鏈高保守小非編碼RNA[4]，通過與靶向mRNA的3′-非翻譯區(three prime untranslated region,3′-UTR)中的互補序列結合，負向調節靶基因表達水平。對細胞的生長、分化、增殖、凋亡起重要調節作用，與許多疾病的發病機制有關。研究表明，多種miRNA在DKD進程中起關鍵作用，如miR-192、miR-24、miR-29a等[5-7]。目前有關miR-27a的相關機制研究主要集中在抗腫瘤領域，也涉及對脂代謝、動脈硬化[8]、心血管疾病[9]、炎癥、氧化應激、腎素-血管緊張素系統[6]、胰島素抵抗[10]的影響，但其對DKD進程的作用機制還不明確。現就miR-27a與DKD發病機制的研究進展予以綜述。

1 miR-27a通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ信號通路影響DKD

1.1介導足細胞損傷 足細胞即腎小球囊臟層上皮細胞。足細胞的足突參與構成腎小球的濾過屏障，同時對維持腎小球濾過屏障的完整性有重要作用。足細胞損傷是引起蛋白尿的關鍵因素，其結構完整性受損或數量減少可引起糖尿病性或非糖尿病性腎小球疾病中蛋白尿的產生及腎小球的纖維化[11]。足細胞特異性分子(足細胞裂隙膜蛋白、足細胞特異性突觸連接蛋白)減少會導致足細胞損傷及上皮間充質轉化(epithelia-mesenchymal transition,EMT)增強[12-13]。

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)是細胞增殖分化中的重要調節因子。PPAR家族包括PPARα、PPARβ/δ和PPARγ，在多基因調節中起重要作用。不同亞型分布于不同組織，PPARγ廣泛分布于心、腎、脾及小腸，具有調節脂肪生成、炎癥、細胞增殖和分化及糖代謝的作用[14]。

miR-27a通過miR-27a/PPARγ/β-聯蛋白軸介導足細胞損傷，受損的足細胞與系膜細胞間的信號傳遞或由于足細胞丟失引起的血流動力學因子產生，可刺激系膜細胞ECM合成增加及降解減少，加重DKD進展。研究表明，高糖環境下，足細胞中的miR-27a表達水平上調，且其表達水平呈現出葡萄糖作用時間及濃度依賴性[15]。PPARγ為miR-27a的直接下游靶基因。miR-27a直接與PPARγ mRNA的3′-UTR特異性結合，引起PPARγ的磷酸化。由此激活β聯蛋白及其下游靶基因鋅指轉錄因子1、α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)[16]，同時，因α-SMA基因的啟動子中含有2 個Smad3反應區，Smad3可促進α-SMA的表達[17]，因此該信號通路對于EMT也有影響，能促使腎小球和腎小管、腎間質纖維化，從而引起一系列β聯蛋白依賴性足細胞改變，如EMT增強、足細胞特異性標志減少、足細胞凋亡等，導致足細胞的數量減少、腎小球的結構完整性受損、腎小球基膜受損、裸露以及球囊粘連等[18]。通過靶向PPARγ,miR-27a能引起DKD中不同類型細胞的下游信號通路激活，從而共同加劇疾病的惡化。

1.2促進腎組織纖維化 腎臟纖維化是各種原因導致的慢性腎臟病，包括原發性、繼發性腎小球疾病、腎小管、間質及血管疾病以及腎臟移植慢性排斥性病變進展成為終末期腎病的最后共同通路[19]。腎組織纖維化的主要病理特征為腎臟喪失了原有正常的腎單位結構，包括腎小球硬化、腎小管間質纖維化等。DKD中腎小球硬化主要繼發于系膜細胞、足細胞損傷，腎小管易受組織缺氧、炎癥、高糖環境及免疫因子損傷等影響，隨著刺激時間的延長，腎組織纖維化產生[20-21]。以大量成纖維細胞、肌成纖維細胞增殖以及EMC(膠原纖維、纖粘連蛋白等)的產生蓄積為特點，同時常伴有腎小血管的硬化，最終導致腎功能損傷甚至喪失[22-24]。腎小球硬化由腎小球系膜細胞、足細胞及腎小管上皮細胞等多種細胞損傷共同參與，是DKD的主要病理改變[25-26]。

轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)在DKD中的生物學活性主要表現為促進腎臟組織纖維化進程。①對ECM的影響。TGF-β1對ECM蛋白的調節作用主要包括兩個方面：增加其合成，通過激活基質降解抑制酶(如組織金屬蛋白酶抑制劑以及纖溶酶原激活物抑制劑)的活性實現；減少其正常降解，主要通過抑制基質降解酶(如基質金屬蛋白酶和纖溶酶原激活物)的活性實現。兩者共同導致ECM沉積，包括基膜成分(Ⅳ型膠原、硫酸肝素、Laminin等)和間質成分(Ⅰ型、Ⅲ型膠原、纖粘連蛋白等)。②對細胞增殖方面的影響。TGF-β1可抑制上皮細胞的生長，如腎小球上皮細胞、腎小管上皮細胞以及支氣管上皮細胞等；同時對內皮細胞的增殖也有一定的抑制作用；對于間充質源性的細胞有雙重調節作用，即高濃度時抑制而低濃度時促進其增殖[22]。TGF-β1能誘導腎小管上皮細胞轉分化為肌成纖維細胞，從而促進ECM的產生及蓄積[27]。TGF-β1的促纖維化作用主要依賴于轉錄因子Smad3介導的細胞內信號激發，Smad蛋白家族是TGF-β1受體的作用底物。TGF-β1實現促腎組織纖維化主要通過TGF-β1/Smad信號通路途徑：TGF-β1能通過磷酸化作用使Smad2和Smad3激活，激活后的Smad2、Smad3隨后與共用Smad4結合，形成復合體進入細胞核與靶基因結合調節基因的轉錄及轉錄后修飾。此外，TGF-β1/Smad信號通路在誘導肌成纖維細胞分化過程中對α-SMA基因表達具有調節作用[18]，兩者能共同引起ECM的產生導致纖維化。但部分非Smad通路也可能參與促腎組織纖維化進程[25]。TGF-β1信號通路除通過誘導EMT外，還能誘導生理或病理條件下的內皮-肌成纖維細胞轉化，腎臟內皮細胞通過內皮-肌成纖維細胞轉化在早期DKD的纖維化進程中發揮作用。TGF-β1/Smad3信號通路能誘導巨噬細胞-肌成纖維細胞轉化，巨噬細胞-肌成纖維細胞轉化是能夠產生大量膠原纖維的α-SMA+肌成纖維細胞的重要來源，該過程能促進腎臟纖維化[28]。

結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)對維持ECM的動態平衡起關鍵作用。CTGF能增強間充質細胞中ECM的生成、細胞黏附以及膠原基質的收縮，通過von Wille-brand因子C結構域與TGF-β1結合，使其與受體的結合能力增強，增加TGF-β1的水平，并參與調節其信號轉導[29]。TGF-β1/Smad3信號刺激CTGF的表達，促進EMT、刺激成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，在纖維化進程中起關鍵作用。

miR-27a作為miR-27a/PPARγ/TGF-β1/Smad3信號通路中TGF-β信號轉導的上游調控因子而存在，miR-27a通過直接靶向PPARγ，在引發DKD纖維化發展的關鍵因子形成的瀑布式反應中發揮始動作用。高糖環境下，miR-27a表達水平增高，miR-27a通過直接靶向PPARγ mRNA的3′-UTR使其磷酸化，抑制PPARγ水平，進而激活TGF-β1/Smad3信號通路。TGF-β1/Smad3信號通路的激活一方面能促進CTGF的表達以及EMT；另一方面能使成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，上調成纖維細胞中基質基因(如纖粘連蛋白及Ⅰ、Ⅳ型膠原蛋白等)的表達，共同促進腎組織纖維化，加快DKD的進展。研究表明PPARγ激動劑(羅格列酮)能通過miR-27a/PPARγ/TGF-β1/Smad3軸對DKD進展有確切的延緩作用，但具體相關機制尚不明確[30]。

2 miR-27a與內質網應激及相關腎臟結構損傷

miR-27a上調能誘導DKD中內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)和相應足細胞損傷。叉頭狀轉錄因子O1(forkhead transcription factor O1,FoxO1)是miR-27a引發DKD中ERS及足細胞損傷的靶基因，miR-27a能與FoxO1 mRNA的3′-UTR結合，通過負向調節作用使其表達水平下調[31-33]，從而影響細胞增殖[31,34]，與足細胞的凋亡有關。該過程能被miR-27a的競爭性內源性RNA——長基因間非編碼RNA1619調節，即在高糖環境下長基因間非編碼RNA1619表達水平下降促進了miR-27a對FoxO1的抑制作用，繼而引起ERS及相關足細胞損傷[35]。

FoxO1是Fox基因家族中的O亞族。FoxO1能夠參與調控細胞的自噬、增殖與分化、胰島素的合成和調節線粒體功能等多種細胞進程。FoxO1可通過調節線粒體自噬、減少氧化應激產物的過度釋放而改善糖尿病足細胞的氧化應激損傷[36-37]。miR-27a能使FoxO1的表達水平下降，促進DKD中足細胞的氧化應激損傷，引發ERS。

內質網對細胞穩態的維持、發育和應激反應至關重要，是蛋白質、糖、脂合成、加工、代謝的主要場所。內質網易受各種刺激(如氧化應激、炎癥反應、營養缺乏等)影響導致其功能紊亂，蛋白合成代謝速率下降，大量未折疊或錯誤折疊蛋白蓄積于內質網腔，繼而誘發ERS[38-39]。ERS根據發生機制可分為因未折疊或錯誤折疊蛋白蓄積于內質網腔誘發的未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)、正確折疊蛋白質在內質網內過度蓄積引發的內質網超負荷反應及膽固醇缺乏誘發的固醇調節級聯反應[40]。DKD中存在高血糖環境、氧化應激、腎素-血管緊張素系統激活、脂質代謝障礙等多種ERS的誘發因素，如DKD患者體內糖基化終末產物、非酯化脂肪酸、高級氧化蛋白產物蓄積可引起UPR。適度的UPR可以通過自噬等協調作用減輕蛋白質錯誤折疊及其后果，有利于細胞內環境穩態的維持和恢復，而嚴重持久的UPR引起非適應性ERS會激發促凋亡信號，如C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)、Tribbles同源蛋白3、c-Jun氨基端激酶、caspase-12等，使細胞損傷，最終發生凋亡[41-43]，熊去氧膽酸、4-苯基丁酸等可通過下調ERS相關蛋白(內切型X盒結合蛋白1、CHOP、caspase-12)的表達，以及改善血糖水平及胰島素抵抗發揮逆轉系膜擴展、調節腎臟細胞自噬、抑制凋亡等作用，可為DKD的治療提供依據[43]。內質網應激相關機制可導致腎臟足細胞、系膜細胞、內皮細胞損傷，加快DKD進程。

2.1ERS相關足細胞損傷 足細胞附著于腎小球基膜，需要消耗大量能量以維持正常生理功能，加之其內質網有較強的蛋白折疊能力及合成、分解代謝活躍，因此對于氧化應激非常敏感，易受ERS影響[41]。DKD患者體內存在的高糖環境可使miR-27a表達水平上調，促進誘導產生活性氧類，同時結合代謝異常所致非酯化脂肪酸在內質網腔異常蓄積，引發足細胞UPR，促進足細胞凋亡，加重DKD進程。

研究表明FoxO1能減輕糖尿病大鼠中高糖誘導的足細胞損傷，能使其抗氧化基因的表達上調，從而促進活性氧類的清除能力，抑制UPR及相應足細胞損傷及凋亡[44-45]。有研究表明，將FoxO1基因轉染于DKD小鼠足細胞，并通過抑制磷酸化提高其轉錄活性后，足細胞標志蛋白nephrin有所回升，而原先增多的間質標志蛋白水平下降，說明FoxO1可延緩甚至一定程度上逆轉EMT的發生，緩解糖尿病腎臟病變[46]。miR-27a作為FoxO1的上游調控基因，可能通過這一途徑對DKD進程產生影響。

2.2腎小球系膜細胞損傷 系膜細胞能調節腎小球的濾過作用、吞噬凋亡細胞、維持系膜基質穩態等，系膜細胞損傷是DKD進程的重要環節。高糖下miR-27a誘導產生的活性氧類瀑式反應、糖基化終末產物、高級氧化蛋白產物、脂肪酸結合蛋白4增加等都易誘導系膜細胞發生ERS，從而導致系膜細胞增殖、ECM過度生成等，共同促進DKD進展[41]。糖基化終末產物可通過晚期糖基化終末產物受體/磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路誘導系膜細胞自噬，在一定程度上對系膜細胞因糖基化終末產物引起的凋亡起保護作用。而ERS對該過程具有上游調控作用，從而促進其增殖、分泌細胞因子和系膜外基質產生增多[42]，甚至可以通過ERS的CHOP途徑導致細胞壞死[47]。

2.3腎小球內皮細胞及小管損傷 內皮細胞損傷是糖尿病血管病變的中心事件，高糖誘導的ERS與內皮細胞功能障礙關系密切。研究表明腎小球內皮細胞經高級氧化蛋白產物處理后，內皮細胞標志性分子(上皮鈣黏素、CD31、Claudin-5)表達水平下調，而間充質細胞標志分子(波形蛋白、成纖維細胞特異蛋白)過表達，高級氧化蛋白產物可通過雙鏈RNA依賴性蛋白激酶樣內質網激酶/CHOP途徑誘發ERS引發內皮-肌成纖維細胞轉化，促血管生成素1可通過該途徑抑制腎小球內皮細胞功能障礙[41,48]。小管上皮細胞與小管間質細胞極易受高糖誘導的代謝紊亂影響，導致其損傷。小管間質中ERS相關基因表達上調，表明ERS參與腎小管EMT過程[49]。

3 小 結

目前關于miR-27a與DKD間的各方面作用機制研究還未完全明確。許多研究表明糖尿病高糖環境下miR-27a表達水平上調，能通過抑制PPARγ、FoxO1等激活相關信號通路以及通過誘導ERS導致腎臟的結構及功能改變引起腎功能惡化，加重DKD，增進其向終末期腎病發展的進程。同時，在相關病理生理機制的研究過程中，也提供PPARγ激動劑(羅格列酮)、熊去氧膽酸、4-苯基丁酸等DKD的治療靶點。未來深入研究miR-27a對DKD作用的相關機制，有望為針對DKD的治療提供新的更加有效的診斷、監測及治療策略。