非編碼RNA對冠心病發生發展影響的研究進展

李 平，龐 智，朱劍云，孫琛琛，孫康云

(南京醫科大學附屬蘇州醫院心血管內科 蘇州市消化系疾病與營養研究所，江蘇 蘇州 215008)

冠心病是冠狀動脈血管發生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導致的心臟病，常常被稱為“冠心病”。動脈粥樣硬化是心血管疾病的主要形式，是炎性斑塊和包含多種復雜相互作用的不同類型的細胞和修飾脂蛋白沉積在動脈壁內的慢性炎癥反應[1]。近年來我國居民冠心病及急性心肌梗死死亡率呈快速上升趨勢，農村上升更為明顯。主要原因是高血壓、高膽固醇血癥等主要危險因素持續升高，知曉率、治療率及控制率雖有升高，但仍處于較低水平[2]。男性、肥胖、吸煙、糖尿病、高血壓、高血脂以及相關遺傳因素等危險因素與冠心病的發生相關。目前針對冠心病的診斷方法主要依靠臨床醫師的經驗、物理診斷和臨床生化指標實驗診斷。早發冠心病易感基因和特征性炎癥介質的研究成果使冠心病易感人群的大規模篩選具有了可能性，也有利于冠心病預防的關口前移，這是近年國內外研究的熱點之一。

全球性的轉錄分析發現66%的基因組被轉錄，其中80%是呈現活性轉錄的生物化學標記，然而不到2%的能夠編碼蛋白質[3]。絕大多數非編碼的調控元件被轉錄成非編碼RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs)[4]。近年來，ncRNAs作為冠心病早期診斷血液標志物的研究已成為當前的研究熱點，現從ncRNA入手，對近幾年的研究進展進行綜述。

1 微RNA與冠心病的關系

微RNA(microRNA，miRNA)是一種小型(19～25 nt)單鏈ncRNA，轉錄后調控基因表達，在細胞代謝、分化、增殖和凋亡等多種生物過程中起著至關重要的作用[5-6]。研究發現，miRNA具有組織特異性，并且與心血管系統生理及病理變化相關[7]。此外，由于miRNA片段較小，在體液中能夠穩定檢測到，并且能夠耐受內源性RNA酶的降解作用[8]。這些優勢使得miRNA能夠成為心血管疾病早期篩查比較理想的生物標志物之一。

近幾年，關于miRNA的研究非常多，在冠心病患者中發現了許多與健康對照組差異表達的miRNA。研究發現，這些與冠心病疾病相關的miRNA，通過影響脂質代謝，血管內皮細胞的增殖、凋亡，炎癥反應以及端粒長度來影響冠心病的發生發展。

1.1脂質代謝相關miRNA與冠心病 miR-370在脂類代謝中起關鍵作用，能夠下調肉堿棕櫚酰轉移酶1α基因的表達從而控制脂肪酸氧化作用[9]。取臨床95例冠心病患者和50例健康組血漿，使用實時熒光定量聚合酶鏈反應法進行比較，發現miR-370在冠心病患者中較正常人表達量明顯升高[10]。miR-24與體內油脂的積累以及高三酰甘油血癥密切相關，在早期和晚期動脈粥樣硬化斑塊中被公認為特異性miRNA[11]。miR-33a被認為是維持細胞膽固醇穩態的關鍵后轉錄調控基因，與脂肪酸氧化的重要基因如膽固醇運輸基因ATP結合盒轉運蛋白A1、腺苷三磷酸結合盒亞家族G1抗體和尼曼-皮克病C1型相關聯[12]。miR-103a參與細胞輔酶A和脂質代謝途徑[13]。miR-122調節與脂質合成及氧化相關的基因包括固醇調節元件結合蛋白、微粒體三酰甘油轉移蛋白、Krupple 樣因子6和陽離子氨基酸轉運蛋白基因，沉默miR-122會導致血漿中總膽固醇和三酰甘油水平降低。運用實時熒光定量聚合酶鏈反應法檢測161例臨床冠心病患者和150例健康組單核粒細胞中miRNA的表達水平，發現miR-24、miR-33a、miR-103a和miR-122在冠心病患者中表達量高于健康組[14]。50例家族性高膽固醇血癥患者血漿中miR-130a-3p表達水平較24例健康組下調，另外，miR-130a-3p與冠狀動脈粥樣硬化程度呈負相關[15]。

1.2細胞增殖、凋亡相關miRNA與冠心病 miR-206在冠心病患者血漿和患病的內皮祖細胞中表達量均較高，miR-206能夠明顯抑制冠心病患者內皮祖細胞的生存和侵入能力，增加內皮祖細胞的凋亡。并且發現miR-206能夠抑制血管內皮生長因子的表達[16]。同時，miR-126能夠通過上調血管內皮生長因子的表達來調節血管的完整性和血管發生，并且在小鼠體內進行miR-126敲除會導致血管的滲漏[17]。在82例冠心病患者血漿中miR-126表達量明顯較42例健康組低[18]。研究發現，在冠心病患者的血清和血管平滑肌細胞中，miR-574-5p的表達水平較高。另外，miR-574-5p通過抑制ZDHHC14(zinc finger DHHC-type containing 14)基因的表達來促進細胞增殖和抑制細胞凋亡[19]。miR-362-3p抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移，阻礙了細胞G1/S周期的轉變。生物信息學分析表明，miR-362-3p與血栓形成的一種分離蛋白和金屬蛋白酶凝血酶敏感素1型基序的解聚素樣金屬蛋白酶結合，能夠抑制其mRNA和蛋白的表達，在110例冠心病患者血漿中miR-362-3p表達量較84例健康對照明顯下調[20]。與正常的冠狀動脈組織相比，miR-448在冠狀動脈粥樣斑塊的血管平滑肌中表達上調，肌細胞增強因子2C過表達降低了miR-448誘導的血管平滑肌細胞的增殖和遷移[21]。冠心病患者內皮祖細胞功能失調，是由循環miR-146a和miR-146b在心血管中的負反饋循環引起的。研究表明，miR-146a-5p和miR-146b-5p與許多血管生成相關的基因關聯，這些基因在冠心病患者內皮祖細胞中下調表達[22]。研究結果顯示，在冠心病患者中miR-939表達下調。miR-939通過靶向γ聯蛋白來抑制血管生成，破壞了血管的完整性。在人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)中過表達miR-939能夠明顯抑制細胞增殖、黏附和血管生成，但是會增加細胞的遷移[23]。miR-133a的轉錄濃度梯度增加與急性冠狀動脈綜合征患者的病死率增高有關，而且增加了穩定的冠心病患者支架內再狹窄新的血管化發生率[24-25]。miR-499在216例冠心病患者中較90例健康組中上調表達，下調表達miR-499能夠通過抑制腫瘤壞死因子-α激活核因子κB信號通路來保護冠心病內皮細胞免受炎癥的損害[26]。miR-20a在冠心病患者中較健康組下調表達，能夠特異性結合人第10號染色體缺失的磷酸酶的3′非翻譯區，通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路來增加血管內皮細胞的成活和增殖[27]。

1.3炎癥反應相關miRNA與冠心病 與內皮細胞相關的miR-126也能夠通過介導細胞間黏附因子1的白細胞浸潤來抑制血管的炎癥反應[28]。在冠心病患者中miR-22在外周血單核細胞中下調表達，miR-22可以通過負調控單核細胞趨化蛋白1靶向參與炎癥反應從而導致冠心病的發生[29]。血清中miR-21水平與內脂素水平呈正相關，急性冠狀動脈綜合征患者血清miR-21水平明顯高于穩定冠心病患者，血清miR-21和內脂素的增加可能促進急性冠狀動脈綜合征的炎癥反應，也可能來自急性冠狀動脈綜合征的炎癥反應。此外，miR-21和內脂素在斑塊不穩定性和炎癥中的潛在作用還值得進一步研究[30]。在動脈粥樣硬化的炎癥反應中，miR-10a與血清白細胞介素-10水平呈正相關，與健康組相比，miR-10a在冠心病患者組表達下調[31]。

1.4端粒相關miRNA與冠心病 端粒重復結合因子在端粒的維持中起重要作用，miR-23a可以直接抑制端粒重復結合因子的表達，從而誘導端粒縮短和細胞衰老。高水平的miR-23a通過下調端粒重復結合因子的表達，誘導端粒縮短，與冠狀動脈疾病患者的臨床預后不良有關[32]。

2 長鏈非編碼RNA與冠心病的關系

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類轉錄本長度>200 bp的ncRNA，沒有任何潛在的編碼蛋白質的能力[33]。lncRNA因其細胞和組織的特異性可以作為癌癥的生物標志物和治療靶點，并且可以在凋亡或壞死腫瘤細胞分泌或釋放的血液、血漿和尿液細胞中檢測到[34]。越來越多的研究表明，lncRNA在很多癌癥中非正常表達，在細胞增殖、凋亡或侵襲都有一定的生物學功能[35-36]。根據最近的蛋白質編碼基因，lncRNA可以分為5個不同的類型[37]：①正義鏈lncRNAs，與相同鏈的另一個蛋白質編碼基因的一個或多個外顯子相重疊；②反義型lncRNAs，與相反鏈的另一個蛋白質編碼基因的一個或多個外顯子相重疊；③內含子區lncRNAs，來源于次級轉錄物的內含子區域；④雙向lncRNAs，轉錄起始位點與相反鏈上編碼蛋白質基因的轉錄起始位點非常接近，但轉錄方向相反；⑤基因間型lncRNAs，產生于兩個基因之間的區域。

越來越多的研究發現lncRNA與冠心病的發生、發展也有很大的聯系。lncRNA在誘導炎癥反應，血管平滑肌細胞增殖、凋亡，以及脂肪代謝相關方面都發揮重要作用。

2.1細胞增殖、凋亡相關lncRNA與冠心病 在冠心病中lincRNA-p21是一個重要的細胞增殖與凋亡的調節基因，在血管平滑肌細胞中lincRNA-p21能夠抑制細胞增殖，引起細胞凋亡[38]。并且lincRNA-p21的G-A-A-G單倍型與冠心病患病風險降低相關[39]。在外周血單核細胞中通過微芯片以及實時熒光定量聚合酶鏈反應法篩選出3個較好的冠心病lncRNA標志物(CoroMarker、BAT5和IL21R-AS1)，其中CoroMarker在冠心病較其他的心血管疾病中差異表達，特異性和敏感性更好。并且實驗證明這個CoroMarker基因能夠正向調控泡沫細胞的形成和動脈硬化，抑制細胞凋亡、炎癥以及相關免疫反應[40]。H19是一個轉錄lncRNA的印跡基因并且在出生后表達下調。研究首次證明H19的多態性與中國人冠心病的風險和嚴重程度有關[41]。同時，也有研究發現，下調H19基因的表達能夠促進鼠心肌細胞P19CL6的增殖和抑制細胞凋亡，而這個過程是在心臟分化晚期通過負調控miR-19b來完成的[42]。冠心病患者血漿H19和預測心臟重構的基因間lncRNA、LIPCAR水平顯著升高[43]。在508例冠心病患者和562名年齡、性別和種族匹配的健康組中發現，MALAT1中的rs619586AG/GG基因型可預防冠心病的發生。下調MALAT1可抑制血管內皮細胞和血管平滑肌細胞的增殖，減少心肌細胞凋亡，改善左心室功能，與冠心病等諸多病理過程密切相關[44]。MEG3表達水平在冠心病患者中較健康組下調。過表達MEG3能夠抑制miR-21的表達，從而抑制內皮細胞增殖和減少Ⅰ型膠原蛋白，Ⅴ型膠原和蛋白聚糖的表達[45]。

2.2其他與冠心病發生發展相關的lncRNA Fendrr被認為在胚胎期的心臟系統發育中發揮關鍵作用，并且Fendrr具有組織特異性，是心臟和身體壁發育的調節劑[46]。研究發現在冠狀動脈斑塊中，FENDRR的表達明顯下調[47]。Bvht是一個與鼠心臟相關的lncRNA，是激活多功能心血管前體細胞主調控器MesP1上游核心心血管基因網絡和功能的必要條件[48]。在冠心病患者中，LncPPARδ的表達量較正常組增加了2.2倍。下調LncPPARδ的表達會降低過氧化物酶活化受體δ,脂肪分化相關蛋白和血管生成素4的表達[49]。ANRIL的EU741058轉錄本的表達水平可能與冠心病的發展有關[50]。并且從來自6個獨立研究的12 005名受試者中發現，ANRIL等位基因rs4977574與冠心病危險之間存在顯著相關性[51]。H19、MIAT、ANRIL、lincRNA-p21、AC100865.1、OTTHUMT00000387022、NONHSAT112178、Novlnc6、MALAT1、LIPCAR和SRA被認為是冠心病的新型調節基因或生物標志物，參與了冠心病病理的起始和進展[52]。

3 環狀RNA與冠心病的關系

環狀RNA(circular RNA,circRNA)是一種新型的ncRNA，它形成了一個共價閉合的環狀結構[53-54]。在整個物種中，大部分的環是高度保守的，并且經常顯示出組織或表達特異性，在一些心血管疾病和癌癥中通常能檢測到異常表達的circRNA[55]。circRNA大多數定位于細胞質中，少數定位于細胞核內。并且大多數由外顯子形成，少數來源于內含子或內含子片段[56]。其中，很大一部分的環只產生于一個外顯子或多個外顯子。circRNA有miRNA海綿的功能，可以調節基因表達或直接調控基因的剪接和轉錄，同時其也是細胞的潛在調控因子[57]。

3.1細胞增殖、凋亡相關circRNA與冠心病 以表達高糖誘導的血管平滑肌細胞在體外的circRNAs表達譜，circRNAs微陣列分析發現一個上調表達的circWDR77。在體外細胞試驗中，circWDR77沉默顯著抑制平滑肌細胞的增殖和遷移。生物信息學方法發現miR-124和成纖維細胞生長因子2是circWDR77的下游目標。RNA免疫沉淀和(或)熒光素酶功能驗證實驗表明，circWDR77通過靶向miR-124/成纖維細胞生長因子2調控血管平滑肌細胞的增殖和遷移，為糖尿病相關性血管病變提供了新的理論依據[58]。人體circRNA微陣列分析顯示，在氧化低密度脂蛋白誘導的HUVECs中，hsa_circ_0003575得到明顯上調。結果表明，hsa_circ_0003575沉默促進了HUVECs的增殖和血管生成能力。circRNA微陣列分析揭示了HUVECs的表達譜，并驗證了hsa_circ_0003575對HUVECs的作用，為動脈粥樣硬化血管內皮細胞損傷提供了一種治療策略[59]。

3.2其他與冠心病發生發展相關的circRNA 也有研究通過微陣列篩選以及后續的分析發現，在冠心病患者中有9種circRNA(hsa_circ_0089378, hsa_circ_0083357, hsa_circ_0082824, hsa_circ_0068942, hsa_circ_0057576, hsa_circ_0054537, hsa_circ_0051172, hsa_circ_0032970, hsa_circ_0006323)能夠通過抑制hsa-miR-130a-3p來促進瞬態受體電位陽離子通道亞家族M成員3的表達[60]。在137例冠心病患者中hsa_circ_0124644較115名健康組明顯上調[61]。經基因芯片從6名冠心病患者及6例正常對照者中篩選，后經實時熒光定量PCR法從20對臨床樣本中驗證發現外周血hsa-circRNA11783-2與冠狀動脈疾病和2型糖尿病相關[62]。

目前對于circRNA與冠心病的相關研究還處于早期研究階段，對深入機制的研究還未成熟，有待更加深入的發現和探索。

4 小 結

ncRNA在冠心病發生發展及在疾病的診斷和預測方面具有重要價值，并且成為近幾年國內外研究的重點之一。miRNA片段較小，在體液中能夠穩定檢測到，并且能夠耐受內源性RNA酶的降解作用。lncRNA具有組織特異性，并且參與細胞內多種生物過程的調控。而最近研究非常廣泛的circRNA，具有高度保守性，并且呈封閉環狀結構，不易被核酸外切酶降解，更加穩定。具有以上優勢，并且與疾病的發生發展密切相關，使得ncRNA成為新型的生物標志物。同時lncRNA、circRNA與miRNA有著非常密切的聯系，lncRNA可以作為一種競爭性內源性RNA與miRNA相互作用，參與靶基因的表達調控。對ncRNA全面的總結也為miRNA、lncRNA、circRNA的通路研究提供更多借鑒意義，隨著研究的不斷進展和深入，ncRNA有望真正應用于臨床，作為冠心病篩查的生物標志物和治療靶標。