高危型人乳頭瘤病毒載量對不同宮頸病變調節性T淋巴細胞表達的影響研究

余楊，付艷麗，孫翔

高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）持續性感染是導致宮頸上皮內瘤變（CIN）及宮頸癌的主要病因［1-4］。發達國家建立的完善篩查體系，使宮頸癌的發病率和病死率顯著下降，新發病例居于全身惡性腫瘤的第10位，而在發展中國家，新發病例位于第2位［5］。由此可見，基于HR-HPV建立可進一步分選出高級別CIN和宮頸癌高危人群的合理篩查體系很重要和迫切。腫瘤是多種因素共同作用的結果，HR-HPV持續性感染是宮頸癌發生的必要條件，卻非唯一致病條件，HR-HPV感染后誘發的宮頸病變轉歸與機體免疫功能，尤其是宮頸局部微環境免疫功能密切相關［6］。機體免疫調控復雜多樣，免疫細胞之間，外來抗原HR-HPV和免疫細胞之間，HR-HPV、免疫細胞與局部微環境之間均存在相互制約、相互調節的交互作用和交聯影響。免疫抑制細胞構筑的免疫抑制微環境通過免疫耐受、免疫逃逸等機制促進宮頸病變的進展［7］，調節性T淋巴細胞（Treg）是一群發揮免疫抑制功能的獨特輔助性T淋巴細胞亞群，叉頭翼狀螺旋轉錄因子3（Foxp3）是Treg的特征性分子標志，可對腫瘤免疫應答從啟動到效應的整個階段全程調控。本研究同步監測宮頸局部微環境HR-HPV載量和Treg變化，探討其與宮頸病變進程的聯系和發展趨勢，為HR-HPV持續性感染者更深入地分流診治提供臨床依據。

本研究背景：

宮頸癌的發生、發展是多種因素參與調控的復雜過程，僅高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）誘導細胞內DNA突變是不夠的，還需在慢性炎癥的持續刺激下不斷累積變異，再加上微環境改變腫瘤細胞的生物學特性，發生惡性特征轉化的強大激活信號，基因組、微環境、炎癥和免疫體系發生改變的綜合結果導致了癌變的風險，因此，HR-HPV持續性感染是宮頸癌發生的必要條件而非充分條件，基于HR-HPV感染并能方便、無創、準確量化地反映宮頸癌生物學行為變化的標志物是臨床重點。目前宮頸局部微環境中HR-HPV載量對調節性T淋巴細胞（Treg）表達的影響及其兩者同時在HR-HPV免疫逃逸和宮頸病變進程中相互作用的報道較少。本研究圍繞HR-HPV抗原既可激發免疫反應又可負向抑制免疫反應的特點，探討不同微環境誘導的Treg表達差異對宮頸病變進程或促進或抑制的雙向影響，為宮頸癌前病變以及宮頸癌個性化診療方案提供實驗指導和臨床思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年1月—2015年7月河南理工大學第一附屬醫院經液基薄層細胞檢測技術（TCT）篩查、HR-HPV基因分型檢測〔聚合酶鏈式反應（PCR）-反向點雜交法〕，最終經陰道鏡下宮頸多點病理活檢確診的HR-HPV持續性感染的不同宮頸病變患者342例，年齡38～55歲；其中慢性宮頸炎55例、CINⅠ級73例、CINⅡ級71例、CINⅢ級72例、宮頸癌71例。納入標準：（1）有1年以上性生活史；（2）經2名以上有經驗病理科醫師確診；（3）患者本人知情同意。排除標準：（1）妊娠期婦女；（2）合并其他惡性腫瘤或自身免疫性疾?。唬?）近期使用過免疫抑制類藥物；（4）人類免疫缺陷病毒（HIV）陽性；（5）有放化療史；（6）2周內接受過局部或全身抗病毒藥物治療。HR-HPV持續性感染的定義：HR-HPV感染者隨訪1次/6個月，在間隔6～12個月相鄰兩次隨訪中，同一例患者宮頸檢測樣本均顯示HR-HPV陽性且為同種類型，修改為第1年隨訪1次/4個月，以后至少1次/6個月（依據病情動態監測），持續時間均在2年以上［8-9］。

1.2 主要儀器與試劑 流式細胞儀購自美國BD FACS Calibur，配有BD CellQuest軟件。試劑：鼠抗人異硫氰酸熒光素（FITC）-CD4單克隆抗體、鼠抗人PE-CD25單克隆抗體、鼠抗人PE-Cy5-Foxp3單克隆抗體均購自美國eBioscience公司。PCR擴增儀DA7600型和HRHPV核酸定量（16、18、31、33、45、52、56、58共8個型）檢測試劑盒均由中山大學達安基因股份有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 采用宮頸刷取物制備宮頸病變單細胞懸液 采用陰道窺器暴露宮頸，干棉球拭凈宮頸口過多分泌物，觀察宮頸，將刷頭插入宮頸管，中央較長的刷絲針對準新鮮病變部位，順時針或逆時針旋轉3～5圈，取下刷頭，并將其浸泡在含液基細胞學保存液的瓶中，300目尼龍網過濾雜質，取10 ml保存液轉入15 ml試管，402×g離心5 min，棄上清液，取2 ml沉淀液，以磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗2～3次，45×g離心沉淀1～2 min，進行細胞計數，不少于106個。

1.3.2 流式細胞儀檢測單細胞懸液中Treg 調整細胞濃度至（1～2）×107個/ml，用PBS洗滌、重懸，取上述細胞100 μl，加入鼠抗人FITC-CD4單克隆抗體、鼠抗人PE-CD25單克隆抗體各5 μl，混勻，室溫避光20 min，加冷固定破膜劑1 ml，4 ℃避光孵育30 min，加破膜緩沖液2 ml，洗滌2次，棄上清液，加鼠抗人PE-Cy5-Foxp3單克隆抗體進行細胞內染色，4 h內進行流式細胞儀檢測。用空白管調節電壓，以CD25同型對照調節補償，確定細胞群，再以細胞設門，以Foxp3同型對照確定陽性信號，最后測定C管，檢測Foxp3+細胞占C細胞的百分比。

1.3.3 HR-HPV載量檢測 無菌條件下采用宮頸刷插入宮頸內，旋轉數圈后停留片刻取出，將宮頸刷置入無菌管，采集的宮頸分泌物及時送檢或4 ℃保存1周內檢測。DNA提取和PCR擴增按其說明書（PCR熒光法）進行具體操作。根據HR-HPV載量拷貝數分為4組：低載量組（104～105copies/ml）69例、中載量組（＞105～106copies/ml）90例、高載量組（＞106～107copies/ml）106例、超高載量組（＞107copies/ml）77例。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計學處理。計量資料以M（P25，P75）表示，HR-HPV載量經對數轉換，多組間比較采用秩和檢驗，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson簡單相關分析及偏相關分析；選用簡單和復式箱型圖解析數據分布，繪制散點圖加趨勢擬合線描述線性關系。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 繪制HR-HPV載量標準曲線 PCR熒光法閾值設定原則是值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點，且循環閾值（Ct）不出現任何數值。以標準品4個濃度（1×103～1×106copies/ml）的對數值為橫坐標，Ct為縱坐標，繪制標準曲線（見圖1）。Ct與樣本起始模板的拷貝數呈正相關，與起始模板拷貝數對數值間有嚴格的線性反比關系。

圖1 PCR熒光法檢測HR-HPV載量的標準曲線Figure 1 Standard curve of HR-HPV load detected by QF-PCR

2.2 低載量組、中載量組、高載量組、超高載量組患者年齡及Treg比較 低載量組、中載量組、高載量組、超高載量組患者年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。低載量組、中載量組、高載量組、超高載量組患者Treg比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中中載量組、高載量組、超高載量組患者Treg較低載量組升高，高載量組、超高載量組患者Treg較中載量組升高，超高載量組患者Treg較高載量組升高，差異均有統計學意義（P＜0.05，見表1）。復式箱型圖顯示各組均無異常值，HR-HPV載量逐步增加，Treg分布愈加分散，超高載量組Treg分布最分散，低、中載量組Treg分布較為集中（見圖2）。

2.3 慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌患者年齡、Treg及HR-HPV載量比較 慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌患者年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌患者Treg、HR-HPV載量比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；其中CINⅠ級患者Treg較慢性宮頸炎升高，CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌患者Treg、HR-HPV載量較慢性宮頸炎、CINⅠ級升高，CINⅢ級患者Treg較CINⅡ級升高，宮頸癌患者Treg、HR-HPV載量較CINⅡ級、CINⅢ級升高，差異均有統計學意義（P＜0.05，見表2）。復式箱型圖顯示在慢性宮頸炎中有1個溫和的異常值，其余病變組無異常值，隨宮頸病變程度的加重，Treg分布愈加分散，宮頸癌組Treg分布最分散，低宮頸病變Treg分布較為集中（見圖3）；在慢性宮頸炎和宮頸癌中共有3個溫和的異常值，其余病變組無異常值，隨宮頸病變程度的加重，HR-HPV載量分布趨向分散，宮頸癌組HRHPV載量分布最分散，低宮頸病變HR-HPV載量分布較為集中（見圖4）。

表1 低載量組、中載量組、高載量組、超高載量組患者年齡及Treg比較〔M（P25，P75）〕Table 1 Comparison of age and number of Treg in patients with different cervical lesions by HR-HPV load

圖2 低載量組、中載量組、高載量組、超高載量組患者Treg分布Figure 2 Distribution of the number of Treg in patients with different cervical lesions by HR-HPV load

2.4 低載量組、中載量組、高載量組、超高載量組不同病變患者分布 低載量組、中載量組、高載量組、超高載量組宮頸病變分布比較，差異有統計學意義（P＜0.05，見表3）。復式箱型圖顯示，在低、中載量組不同宮頸病變的Treg分布較為集中，高、超高載量組不同宮頸病變的Treg分布更加分散，特別是宮頸癌組數值波動幅度較大；低級別宮頸病變不同載量組中Treg集中分布趨勢明顯，僅CINⅠ級在高載量組有小幅波動，高級別CIN和宮頸癌在低、中載量組Treg分布較為集中，在高、超高載量組數據分散，波動明顯，幅度較大（見圖5）。

2.5 相關性分析 簡單相關分析顯示，HR-HPV載量與宮頸病變、Treg呈正相關（r=0.631、0.683，P＜0.05），組別與宮頸病變、Treg呈正相關（r=0.612、0.686，P＜0.05），宮頸病變與Treg呈正相關（r=0.863，P＜0.05）。控制組別后，偏相關分析顯示，HR-HPV載量與宮頸病變、Treg呈正相關（r=0.204、0.137，P＜0.05）， 宮 頸 病 變 與 Treg呈 正 相 關（r=0.770，P＜0.05）?？刂芓reg后，偏相關分析顯示，宮頸病變與HR-HPV載量呈正相關（r=0.114，P＜0.05），組別與宮頸病變無直線相關關系（r=0.053，P＞0.05）。以組別為橫坐標，Treg為縱坐標，宮頸病變作為點標簽繪制散點圖并添加總體趨勢擬合線（R2=0.572），結果顯示，此三變量之間存在線性關系，子變量慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌的趨勢擬合線決定系數R2依次為0.559、0.339、0.653、0.546、0.085。不同宮頸病變與HR-HPV載量、Treg的擬合線決定系數R2分別為0.399和0.789（見圖6）。

表2 慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌患者年齡、Treg及HR-HPV載量比較〔M（P25，P75）〕Table 2 Comparison of age，number of Treg and HR-HPV load in patients with chronic cervicitis，CINⅠ，CINⅡ，CINⅢ and squamous carcinoma of the cervix

圖3 慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌患者Treg分布Figure 3 Distribution of the number of Treg in patients with chronic cervicitis，CINⅠ，CINⅡ，CINⅢ and squamous carcinoma of the cervix

3 討論

圖4 慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌患者HR-HPV載量分布Figure 4 Distribution of the level of HR-HPV load in patients with chronic cervicitis，CINⅠ，CINⅡ，CINⅢ and squamous carcinoma of the cervix

表3 低載量組、中載量組、高載量組、超高載量組不同病變患者分布Table 3 Distribution of different cervical lesions in patients by the level of HR-HPV load

宮頸病變階梯式緩慢演變進程，加之病因明確、方便取材的優勢，預示著宮頸癌是可以早預防、早發現、早治療的，但事實并不似預期，我國每年新發宮頸癌患者多達13萬，發病年輕化趨勢明顯，10年間下降約5歲［10］?；?、手術和放射等傳統療法難以根治殘留的小病灶或微轉移灶，35%左右的患者因復發或轉移死亡［11］，以激活抗腫瘤免疫為基礎的免疫治療，其臨床療效并不理想，這與腫瘤細胞所處的腫瘤微環境關系密切［12］，主要是免疫抑制微環境負向調控作用的強大。很多病變的早期，機體的全身免疫功能并未出現明顯的改變，但病變局部即已存在免疫抑制。文獻報道，Treg表達強度與HPV-16基因所致宮頸癌變關系密切［13］。本研究結果顯示，HR-HPV載量在宮頸癌變期有相對較大的浮動，在慢性宮頸炎/CINⅠ級之間以及CINⅡ級/CINⅢ級之間HR-HPV載量差異不明顯，提示HRHPV載量與宮頸病變的嚴重程度不總是同步的，一定范圍內HR-HPV載量越高，觸發的抗HR-HPV免疫應答越強，適當的免疫應答有利于HR-HPV清除，但過度的免疫應答反過來損壞免疫功能和靶向組織器官功能，使機體處于HR-HPV感染和免疫功能受損的惡性循環中。HR-HPV載量不能作為區分宮頸病變程度良好的量化指標，但高/超高的HR-HPV載量仍有預警作用，可間接反映機體對病毒的清除能力和感染輕重。相關分析顯示，HR-HPV載量、宮頸病變、Treg均呈正相關，宮頸病變與Treg高度相關；偏相關分析顯示：控制組別后，宮頸病變與Treg仍呈正相關，相關系數較簡單相關分析稍微下降；控制Treg后，宮頸病變與組別間不再有直線相關性。提示HR-HPV載量、Treg、宮頸病變3個變量之間存在交互影響，Treg較HR-HPV載量與宮頸病變進展更具相關性，HR-HPV持續感染是宮頸病變進展惡化過程中必要條件的第一步，宮頸局部微環境免疫失衡是關鍵環節，推測病變進展到重度CIN和宮頸癌程度后，細胞的惡性轉化可能不再依賴HR-HPV的高載量。

圖5 低載量組、中載量組、高載量組、超高載量組不同病變患者Treg分布Figure 5 Distribution of the number of Treg in patients with different cervical lesions by the level of HR-HPV load

圖6 低載量組、中載量組、高載量組、超高載量組不同病變患者Treg分布Figure 6 Distribution of the number of Treg in patients with different cervical lesions by the level of HR-HPV load

HR-HPV感染不是全身的，不形成病毒血癥。腫瘤微環境是有別于人體正常內環境的復雜系統，具有低氧、低pH值及高壓的特點，使效應T淋巴細胞轉變為無功能狀態，隨后凋亡，從而損害抗腫瘤免疫反應，在腫瘤的發生、發展過程中至關重要［14］。腫瘤微環境具有異質性，不同的個體、不同的腫瘤，甚至在同一個體的不同部位，均面對不同的免疫微環境，腫瘤免疫治療的療效存在明顯的個體差異，目前多將此歸于腫瘤微環境的異質性［15］。本研究發現，不同HR-HPV載量組別和不同宮頸病變患者Treg均有明顯差異，在超高的病毒載量作用下和宮頸癌變期，Treg分散趨勢明顯，波動明顯，幅度較大，提示HR-HPV載量越高、宮頸病變越重，宮頸局部免疫抑制微環境組成的異質性越顯著，個體差異越大，治療方面應突出個性化的特點；復式箱型圖直觀地顯示了HR-HPV誘導的Treg表達強度在增加宮頸病變這一變量后數值分布的多樣性，提示宮頸局部免疫抑制微環境異質性的復雜多變，組成上和功能上的異質性，為此在注重個體化治療的同時，密切監測微環境的動態變化，及時調整，至關重要；在判定HR-HPV載量與Treg的相關性上，若將宮頸病變視為整體考量，其所起的決定作用為0.572，慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級、宮頸癌所起的決定作用依次為0.559、0.339、0.653、0.546、0.085，換言之，宮頸癌變期宮頸局部免疫抑制微環境異質性最復雜。通過上述統計學分析推測，宮頸癌變期和超高的病毒載量在宮頸局部免疫抑制微環境異質性上發揮了更大和更為復雜的作用，在不同程度宮頸病變、不同HR-HPV載量中Treg表達量及其發揮的功能并由此產生的重要作用并不相同。Treg的免疫抑制作用在HR-HPV相關性宮頸病變的進程變化中，可能因微環境的差異具有雙向性調節：（1）對HPV誘導的持續炎性刺激形成保護性生理防御反應，在防止過強的免疫損傷和清除病原體之間維持平衡，以減緩組織病理損害；（2）免疫逃逸導致機體對腫瘤的免疫無應答或免疫反應低下，促使宮頸癌變。結合本研究結果，Treg在程度較低的宮頸病變和低拷貝的病毒載量時，作用較一致，其表達水平的升高更多是一種應激性保護防御反應的正向作用，提示Treg在病毒感染過程中可使組織損傷程度最小化［16］，致使HR-HPV感染雖持續存在，但患者病情較輕，應動態監護，持續隨訪。Treg在CINⅢ級/宮頸癌和高/超高拷貝的病毒載量時，三者之間不一致性更大，表現多樣，復雜多變。

在HR-HPV相關性宮頸病變中，細胞免疫功能狀態雖不能直接反映抗HR-HPV免疫效應，通過聯合HR-HPV載量等指標能較好地預測HR-HPV感染人群的宮頸病變發展進程。腫瘤的發生和發展不僅依賴于基因突變，還與腫瘤微環境的異質性有關，所有抗瘤和促瘤因素共同組成腫瘤微環境的免疫網絡，腫瘤微環境的動態改變影響抗瘤/促瘤效應平衡，決定腫瘤逆轉、穩定和惡化的轉歸趨向。CD4+Treg負向調節免疫反應的特性，不僅導致HR-HPV慢性感染長時間持續存在，所形成的慢性炎性微環境作為免疫微環境的重要組成部分，在宮頸病變進展過程中作用重大，通過其異質性和動態演變精細調控病毒復制和機體效應之間的相互作用。因此，基于對HR-HPV感染引發人體病變的整體認識，從宮頸局部微環境入手，兼顧正向和負向調控機制，此外，考慮到腫瘤免疫抑制性微環境存在的異質性，在宮頸癌免疫診斷和治療方面應體現個體化特點，助推精準醫療發展。

作者貢獻：余楊進行文章的構思與設計，研究的實施與可行性分析，結果的分析與解釋，撰寫論文；孫翔進行數據收集、整理，統計學處理；付艷麗進行論文的修訂，負責文章的質量控制及審校；余楊、付艷麗對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。