逆針“豐隆”穴對大鼠肥胖的預防作用及對轉錄因子過氧化物酶體增值物激活受體γ的影響

吳佳璟，朱文妍，孫亦農，朱世鵬

逆針灸是針灸的一種，“逆”指未至而迎之，屬于針灸中的“未病先防”，是指在疾病還未發生或是即將要發生之前預先予以針刺治療，激發經絡之氣以預防疾病的發生或者減輕疾病的程度。肥胖是多種疾病如糖尿病、心血管疾病、癌癥等的危險因素，對于肥胖的預防和治療一直是臨床研究熱點和難點。大量研究證實針灸在肥胖的治療上有獨特的優勢［1］，然而逆針灸對肥胖是否有預防作用及其可能的相關機制尚未可知。本研究擬通過觀察逆針“豐隆穴”對大鼠肥胖、瘦素抵抗以及脂肪組織中轉錄因子過氧化物酶體增值物激活受體γ（PPAR-γ）水平的影響，探討逆針灸防治肥胖的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 實驗時間：2016年5—7月。4周齡SPF級雄性大鼠24只，體質量110～120 g，由南京中醫藥大學實驗動物中心提供，隨機分為模型組、逆針組和空白組，每組8只。明暗周期12 h，自由飲食和飲水，環境溫度24 ℃，濕度40%～50%，普通飼料適應性飼養7 d后，模型組和逆針組進行高脂飼料喂養，空白組進行普通飼料喂養，為期12周（全部飼料由江蘇省協同生物有限公司提供）。以大鼠體質量超過空白組20%為肥胖標準。實驗過程遵循南京中醫藥大學實驗動物倫理委員會要求進行。

1.2 主要儀器與試劑 臺式普通離心機以及臺式低溫冷凍離心機（Eppendorf公司），實時熒光定量PCR儀器（Applied Biosystems公司），多功能酶標儀（瑞士TECAN公司），組織勻漿機（上海凈信科技有限公司），光學顯微鏡（OLYMPUS公司），ELISA試劑盒（南京拓輪生物科技有限公司），IP細胞裂解液（上海碧云天生物技術有限公司），qPCR Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司），引物訂購自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.3 干預方法 將逆針組大鼠固定在自制固定器上，待大鼠平靜后，用碘伏消毒雙側“豐隆”穴區域，使用一次性一寸長針灸針，手持柄垂直進針，進針深度7 mm，留針20 min。干預在造模開始的同時進行，每周干預3次，持續進行12周。空白組和模型組同步抓取固定，不干預。

本研究創新點：

首次觀察了逆針灸對于高脂飲食誘導大鼠肥胖的預防作用，并從分子角度揭示了逆針灸對肥胖預防的機制，可能與其使機體對瘦素的敏感性升高，同時減少能量攝取，促進脂肪分解有關，且對預防肥胖有一定價值。

本研究局限性：

本研究觀察周期較短，逆針灸對肥胖的預防是否具有長時間的持續作用，有待進一步觀察。此外，今后研究應進一步關注不同的針刺刺激量產生的效應是否存在差異。

1.4 取材及檢測指標

1.4.1 體質量 干預期間每周測量并記錄各組大鼠的體質量。

1.4.2 標本采集 10%水合氯醛麻醉后，采用腹主動脈采血法每只取血 5 ml，3 000 r/min 離心 15 min（離心半徑 16 cm），分離血清，分裝后置于-80 ℃冰箱中保存備用。之后迅速分離腎周脂肪組織稱重，將部分腎周脂肪組織置于10%甲醛固定液中固定，剩余脂肪組織用液氮速凍，置于-80 ℃冰箱中待測。

1.4.3 脂肪細胞形態學觀察 將固定于10%甲醛固定液中的脂肪組織用石蠟包埋切片，并做常規HE染色。于20倍光學顯微鏡下觀察脂肪細胞形態。然后用Image-ProPlus 6.0軟件分析脂肪細胞面積圖片，每組切片隨機挑選3個200倍視野進行拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。應用Image-Pro Plus 6.0軟件，使用不規則選圖工具，每張照片中隨機圈出5個脂肪細胞，測出單個脂肪細胞面積，并求出每張切片中脂肪細胞的平均面積。

1.4.4 ELISA法檢測血清瘦素水平 取出-80 ℃冰箱中保存的血清，按照ELISA試劑盒中產品說明書上的步驟進行檢測。

1.4.5 qPCR檢測脂肪組織中轉錄因子PPAR-γ水平 每組隨機選擇3個脂肪樣本分別稱取脂肪組織100 mg，按步驟進行RNA的提取，用BioPhotometer生物分光光度計檢測提取的RNA樣品濃度及純度，取1 μg RNA 為模板，按照日本TOYOBO 公司的 ReverTra Ace qPCR RT Kit反轉錄試劑盒說明書的操作步驟進行反轉錄成cDNA，反應體系：5×RT Buffer 4 μl，Primer Mix 1 μl，RT Enzyme Mix 1 μl，RNA 1 μg，DEPC Water 20 μl。反轉錄條件：37 ℃ 20 min，40 個周期；98 ℃ 5 min，40個周期。qPCR按照南京諾維贊公司的AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 產品說明書進行，引物序列見表1，之后放在ABI qPCR儀上進行反應，結果由ABI qPCR儀相應的 Step One Software v2.1 軟件分析。

1.5 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。計量資料以（x ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體質量 干預前、干預第4周3組大鼠體質量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。干預第8周，3組大鼠體質量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中模型組大鼠體質量高于空白組，差異有統計學意義（P＜0.05）。干預第12周，3組大鼠體質量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中模型組、逆針組大鼠體質量高于空白組，差異有統計學意義（P＜0.05）；逆針組大鼠體質量低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

2.2 腎周脂肪組織重量 3組大鼠腎周脂肪組織重量比較，差異有統計學意義（P＜0.001）。模型組、逆針組大鼠腎周脂肪組織重量大于空白組，差異有統計學意義（P＜0.05）；逆針組大鼠腎周脂肪重量小于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表3）。

2.3 脂肪細胞形態學 模型組大鼠脂肪細胞面積較空白組大鼠明顯增大，細胞壁較薄，細胞大小不均勻，新生脂肪細胞較多。逆針組大鼠脂肪細胞較模型組明顯面積減小，細胞大小較為均勻，新生脂肪細胞較小，但是較空白組脂肪細胞面積仍略大。3組大鼠脂肪細胞平均面積比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組大鼠脂肪細胞平均面積大于空白組、逆針組，差異有統計學意義（P＜0.05，見圖1、表4）。

2.4 血清瘦素水平 3組大鼠血清瘦素水平比較，差異有統計學意義（P=0.013）。模型組大鼠血清瘦素水平高于空白組，差異有統計學意義（P＜0.01）；逆針組大鼠血清瘦素水平低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.01，見表5）。

2.5 脂肪組織中轉錄因子PPAR-γ表達水平 3組大鼠脂肪組織中轉錄因子PPAR-γ表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。模型組大鼠脂肪組織中轉錄因子PPAR-γ表達水平高于空白組，差異有統計學意義（P＜0.05）；逆針組大鼠脂肪組織中轉錄因子PPAR-γ表達水平低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表6）。

3 討論

大量研究已證實，針灸在機體多種疾病狀態下有較為顯著的治療作用，其對肥胖的治療效果也較為明確［1-3］。而隨著醫學關注對象逐漸從“已病”轉向“未病”，逆針灸“治未病”的預防思想越來越被重視，而逆針灸也被證實可以預防多種疾病狀態［4］。本研究結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠體質量顯著升高、腎周脂肪組織重量顯著增加、脂肪細胞面積明顯增大，新生脂肪細胞較多，說明高脂飲食造成了大鼠的肥胖以及脂肪異常堆積狀態。與模型組相比，干預第8周時逆針“豐隆”穴對體質量的影響還沒有明顯效果；干預第12周時，逆針組體質量較模型組明顯降低，說明逆針“豐隆”穴針刺效應積累到一定程度，可以顯著改善高脂飲食引起的體質量增加。12周干預結束后，逆針組大鼠的腎周脂肪組織重量較模型組減少，與此同時，逆針“豐隆”穴還能明顯改善脂肪細胞的病理形態，縮小脂肪細胞的體積，抑制脂肪細胞的新生。因此，逆針“豐隆”穴可能通過促進內臟脂肪的分解、改善脂肪的分布和異常堆積、恢復脂肪細胞正常形態來減預防和延緩肥胖的發生發展，其效應的發揮需要一定程度的針刺刺激量積累。

表1 qPCR引物序列Table 1 qPCR primer sequences for PPAR-γ andβ-actin

表2 3組大鼠不同時間體質量比較（x±s，g）Table 2 Comparison of the body weight between 3 groups of rats before intervention，and at the end of the 4th，8th and 12th weeks of intervention

表3 3組大鼠腎周脂肪組織重量比較（x±s，g）Table 3 Comparison of the perirenal fat weight in 3 groups of rats

圖1 3組大鼠脂肪細胞形態學（HE染色，×200）Figure 1 Morphology of adipocytes in 3 groups of rats

表4 3組大鼠脂肪細胞平均面積比較（x±s，mm2）Table 4 Comparison of the average area of adipocytes in 3 groups of rats

表5 3組大鼠血清瘦素水平比較（x±s，ng/ml）Table 5 Comparison of the serum leptin level between 3 groups of rats

表6 3組大鼠脂肪組織中轉錄因子PPAR-γ表達水平比較（n=3，x±s）Table 6 Comparison of the expression level of PPAR-γ in the adipose tissue in 3 groups of rats

瘦素是由脂肪細胞分泌的一種脂肪組織源激素，作用于大腦特別是下丘腦的傳入信號，通過調節食物攝取和能量消耗來協調能量平衡［5］。瘦素不僅可以抑制食欲，增加能量的消耗，還可以抑制脂肪的合成，從而調控脂肪的沉積。研究發現大多數肥胖機體體內并不缺少瘦素，并且血瘦素含量與BMI呈正相關，說明機體對瘦素的反應減弱，稱為瘦素抵抗［6］。大多數高脂飲食會引起血液中瘦素水平升高［6-7］，高瘦素血癥引起的瘦素向大腦轉運減少是瘦素抵抗發展的關鍵因素［8］。本研究結果顯示，模型組血清瘦素水平高于空白組，說明高脂飲食造成大鼠肥胖狀態的同時，升高了血清瘦素水平，出現瘦素抵抗。既往研究發現，在機體存在瘦素抵抗時，常會伴有脂肪細胞數量增多、體積增大，導致脂肪的異常堆積［9］。本研究細胞形態學觀察結果也符合這一表現。在機體瘦素抵抗狀態下，補充瘦素并不能治療肥胖［10］。因此，如何改善瘦素抵抗，是研究關注的重點之一。研究發現，針灸作為治療肥胖的有效療法，在改善瘦素抵抗方面具有一定的作用。如有研究認為針灸可以降低肥胖大鼠血清瘦素水平，增加下丘腦瘦素受體水平，調節肥胖機體血清高瘦素狀態，改善肥胖大鼠的瘦素抵抗狀態［11］；而逆針灸可以改善大鼠更年期瘦素抵抗，從而預防和延緩更年期的卵巢功能減退和脂肪異常堆積［12］。最新研究發現，與口服抑制食欲藥物、飲食療法或者鍛煉相比，針灸可以更顯著地改善肥胖患者的瘦素抵抗［13］。本研究首次觀察了逆針“豐隆”穴對高脂飲食大鼠瘦素抵抗的影響，結果顯示：經過逆針“豐隆”穴預防性治療后，大鼠血清瘦素水平較模型組大鼠明顯降低，說明逆針“豐隆”穴可以緩解血清高瘦素狀態，改善高脂飲食誘導的瘦素抵抗。

PPARs最初由英國科學家ISSEMANN等［14］于1990年首次發現，可分為α、β、γ 3種亞型［15］。PPAR-γ主要在脂肪組織中表達，是脂肪細胞分化和代謝的關鍵調節因子，其不僅能夠調控脂肪細胞的分化、增加脂肪細胞的數量，還能調控脂肪細胞相關基因的表達，從而參與脂肪代謝、影響脂肪細胞的分泌［16］。因此PPAR-γ與肥胖的發生和發展密切相關。CHEN等［17］研究發現，高脂飲食可引起大鼠肝臟PPAR-γ表達水平升高；LESTARI等［18］的研究證實，高脂飲食可引大鼠內臟脂肪組織PPAR-γ表達水平增高。本研究結果顯示，模型組脂肪組織中轉錄因子PPAR-γ水平高于空白組，表明高脂飲食造成了大鼠內臟脂肪PPAR-γ表達的上調，與相關研究結果一致［18］。基于PPAR-γ促進脂肪生成的作用，既往研究證實通過抑制PPAR-γ可以治療肥胖［19］。本研究結果顯示：逆針組大鼠脂肪組織中轉錄因子PPAR-γ水平低于模型組，表明逆針“豐隆”穴可以降低高脂飲食大鼠脂肪組織中PPAR-γ的表達，推測這一調節作用可能是逆針“豐隆”穴可以減少脂肪合成，抑制脂肪分化，最終恢復其正常代謝的重要途徑。

綜上，逆針“豐隆”穴使大鼠對瘦素的敏感性升高，對下丘腦攝食中樞產生作用，減少能量的攝取，促進脂肪分解，是其預防肥胖的重要途徑之一。逆針“豐隆”穴可以有效預防高脂飲食誘導大鼠的脂肪代謝異常，其機制可能與改善瘦素抵抗及調節脂肪組織中轉錄因子PPAR-γ的表達有關。

作者貢獻：朱世鵬進行研究的設計與實施，文章審校；吳佳璟撰寫論文；吳佳璟、朱文妍進行研究實施、評估、資料收集；孫亦農進行質量控制。

本文無利益沖突。