生物酶控制紙漿樹脂障礙的研究進展

孟婷婷，馬樂凡，李洪兵

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生物酶控制紙漿樹脂障礙的研究進展

孟婷婷1，馬樂凡1，李洪兵2

1 長沙理工大學 化學與生物工程學院，湖南 長沙 410114 2 湖南鴻鷹生物科技有限公司，湖南 常德 415400

在制漿造紙過程中，沉積的樹脂會影響紙漿和成紙質(zhì)量，降低設備的運行效率，最終造成經(jīng)濟損失。由于傳統(tǒng)控制樹脂障礙的方法不能很好地解決這一問題，因此具有高效催化和無污染的特性的生物酶法在該方面得到快速發(fā)展。文中介紹了樹脂的成分、存在形式和控制樹脂障礙的生物酶，重點介紹了脂肪酶、甾醇酯酶、漆酶和脂氧合酶控制紙漿中樹脂障礙的機理和工藝研究方面的進展，指出了生物酶控制樹脂障礙技術目前存在的主要問題，提出了該領域的主要研究方向，并對生物酶控制樹脂障礙技術進行了展望。

樹脂障礙，脂肪酶，甾醇酯酶，漆酶，脂氧合酶

樹脂是植物生長過程中的分泌物，廣泛存在于植物中。雖然紙漿中樹脂的含量比較低，但是會對制漿造紙生產(chǎn)過程造成很大的影響，主要表現(xiàn)在以下方面：1) 樹脂沉積在制漿造紙設備上，增加設備停機清洗的次數(shù)，影響生產(chǎn)操作和設備的運行效率，嚴重時甚至損傷設備；2) 樹脂沉積在紙頁的表面，造成孔洞，影響紙張的質(zhì)量，并且造成紙頁的斷頭；3) 樹脂存在于造紙廢水中，增加廢水的毒性[1]。因此，將這種因樹脂沉積而影響制漿造紙生產(chǎn)過程，進而影響產(chǎn)品質(zhì)量的狀態(tài)，統(tǒng)稱為樹脂障礙。目前，控制紙漿中樹脂障礙的措施主要有原料貯存過程中自然風化和生物降解、紙漿化學控制法和生物控制法：原料貯存過程中自然風化和生物降解對紙漿中樹脂的去除量有限，還會影響紙漿的得率和白度；紙漿化學法控制通常只是改變紙漿中樹脂粒子的表面性質(zhì)，不能從根本上去除紙漿中的樹脂，而且化學藥品的加入通常會帶來一些負面的影響，例如，造成生產(chǎn)設備的磨損和腐蝕，增加紙漿中的灰分，影響填料和細小纖維的留著以及紙頁的施膠等；生物控制法包括微生物菌處理和生物酶處理，其中，生物酶處理與制漿造紙生產(chǎn)過程兼容性好，能夠有效地降解樹脂成分，不影響紙頁的質(zhì)量和設備的運行，是控制紙漿樹障礙最理想的方法，也是紙漿樹脂障礙控制技術研究的熱點[2-3]。

1 紙漿中樹脂成分及其存在形式

木材中的樹脂主要包括甘油三酯、脂肪酸、樹脂酸、烷烴、脂肪醇、甾醇、甾醇酯以及少量的蠟狀物 (表1)，其含量占木材總量的2%–8%。樹脂成分因樹種、樹齡、季節(jié)、部位、制漿、漂白方式的不同而存在差異。在制漿造紙過程中，樹脂主要以3種形式存在：1) 形成膠體液滴分散在白水中，甘油三酸酯、甾醇酯形成膠體液滴的內(nèi)核，而樹脂酸、脂肪酸、甾醇因具有羧基和羥基形成膠體液滴的外表面，膠體液滴的穩(wěn)定性和溶解性受到pH、溫度、剪切力等因素影響[4]；2) 以球狀顆粒形式分布在紙漿中的纖維上，影響纖維之間的結合性能和成紙強度[5-6]；3) 存在于紙漿薄壁細胞的內(nèi)部[1]。這3種形式在制漿造紙的過程中會發(fā)生相互轉換。

在機械法制漿過程中，樹脂成分以及性質(zhì)并未發(fā)生變化而容易形成沉積；在硫酸鹽法制漿過程中，甘油三酯、脂肪酸、樹脂酸因發(fā)生皂化反應而溶解，而甾醇、甾醇酯、蠟狀物、脂肪醇等因不易發(fā)生皂化反應而容易形成沉積，從而造成樹脂障礙[7-8]。

表1 松樹、云杉、樺木、楊木以及桉木樹脂成分[7]

漂白方法對紙漿中樹脂的去除影響較大，在無元素氯 (ECF) 漂白過程中，二氧化氯的強氧化作用可以使紙漿中的甾醇、脂肪酸、脂肪醇分別降低70%、70%、90%，但是采用二氧化氯進行漂白會產(chǎn)生有機鹵化物，增加廢水處理的難度[9]。在全無氯漂白方法中，采用過氧化氫進行漂白的方法只能去除極少量甾醇、甾醇酯，因此漂白后紙漿中殘留的樹脂仍然具有明顯的沉積趨勢；而采用臭氧進行漂白的方法對甾醇具有較好的處理效果 (β-谷甾醇被完全去除)，但是對于脂肪酸的處理效果比較差[10-12]。

2 控制紙漿中樹脂障礙的生物酶

目前，應用于控制紙漿樹脂障礙的生物酶主要分為兩類：水解酶和氧化酶。水解酶主要包括脂肪酶和甾醇酯酶，主要作用于甘油三酯和甾醇酯；氧化酶主要包括漆酶和脂氧合酶，主要作用于甾醇和甾醇酯以及樹脂酸等。

2.1 脂肪酶

2.1.1 脂肪酶控制樹脂障礙反應機理

脂肪酶 (Lipase，E.C. 3.1.1.3) 是一種水解酶，能在油-水界面上催化甘油三酯的水解[13-14]。脂肪酶催化甘油三酯水解的反應過程可以分為4步 (圖1)：催化位點羥基氧攻擊甘油三酯的酯鍵，與甘油三酯的羰基形成酰基-酶中間體 (圖1A)；電子通過酰基-酶中間體的酰基氧原子轉移到主鏈殘基的氮原子上，導致甘油二酯的釋放(圖1B)；水作為親核體攻擊酰基-酶中間體，從而形成新的酰基-酶中間體結構 (圖1C)；電子通過酰基-酶中間體轉移到主鏈殘基的氮原子上，釋放出脂肪酸[15-16](圖1D)。脂肪酶催化效率與甘油三酯和脂肪酸、樹脂酸的比例有關，比值越大，脂肪酶的處理效果越好，而脂肪酸、樹脂酸易與漿料系統(tǒng)中的Ca2+反應形成鈣皂，進而形成樹脂沉積[17]。

2.1.2 脂肪酶控制樹脂障礙的工藝

影響脂肪酶控制樹脂障礙效果的因素主要包括漿種、酶源、酶用量、溫度、pH值、時間和紙漿濃度等。脂肪酶控制樹脂障礙的工藝條件及處理效果見表2。

圖1 脂肪酶水解甘油三酯的催化機制[16]

表2 脂肪酶在不同實驗條件下的處理效果

脂肪酶控制樹脂障礙已在國內(nèi)外制漿造紙工廠中得到了廣泛應用。日本的JuJo造紙廠首次采用脂肪酶處理針葉木TMP[21]。隨后，國內(nèi)的很多造紙廠采用脂肪酶處理機械漿中的樹脂。福建南平紙業(yè)采用脂肪酶處理馬尾松TMP，發(fā)現(xiàn)脂肪酶結合硫酸鋁處理后，有害樹脂降解率達70%以上[22]；岳陽林氏集團采用Resinase A脂肪酶處理漂白磨木漿，發(fā)現(xiàn)樹脂平均降解率達22.1%，最高降解率達30.8%[2]。

一些研究表明表面活性劑能提高脂肪酶的樹脂障礙控制效果。徐麗麗等[23]采用豬胰脂肪酶結合表面活性劑對馬尾松TMP進行處理，研究了脂肪酶結合表面活性劑對樹脂的處理效果，得出在酶用量為5 U/g、pH值為7.5、溫度為40℃、紙漿濃度為3%、處理時間為3 h的條件下，脂肪醇聚氧乙烯醚結合脂肪酶處理紙漿的效果最好，其降解率為脂肪酶單獨處理的3倍。Dubé等[24]采用了一種新型可生物降解的非離子型表面活性劑烷基二乙醇酰胺與來自變鉛青鏈霉菌的脂肪酶處理混合針葉木TMP，研究了脂肪酶結合表面活性劑對于樹脂控制的效果，得出在酶用量為10 U/g、溫度為60 ℃、紙漿濃度為4%、表面活性劑用量為0.1% (/) 條件下，樹脂酸、甾醇、甘油三酯的降解率分別48%、32%和78%，而表面活性劑單獨處理時，樹脂酸、甾醇、甘油三酯的降解率分別為32%、17%和39%，可以看出表面活性劑和脂肪酶結合處理效果要優(yōu)于表面活性劑單獨處理的效果。由上可知，脂肪酶的處理效果不僅僅與表面活性劑的性質(zhì)有關，而且與酶源、紙漿的種類也是相關的。

全細胞技術因為能夠保持原有細胞所處的狀態(tài)，具有穩(wěn)定性好、適應性強的特點，而應用于樹脂障礙的控制[25]。眭梁梁[26]采用米曲霉全細胞催化技術來處理造紙白水中的樹脂，研究了固定化米曲霉對于造紙白水的處理效果，發(fā)現(xiàn)將0.1 g脂肪酶米曲霉全細胞凍干粉加入到5 mL 的白水中，在溫度為50℃、反應時間為3 h的條件下，白水中樹脂沉積物的平均粒徑從534 nm下降到356 nm，證明了米曲霉全細胞技術具有控制樹脂障礙的潛力。雖然全細胞催化技術能夠催化甘油三酸酯的水解，但是催化效率不及脂肪酶與底物直接接觸的作用效果。

2.1.3 脂肪酶控制樹脂障礙技術存在的主要問題

盡管脂肪酶控制樹脂障礙技術已實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，并在國內(nèi)外得到了廣泛應用，但在該領域目前還存在很多問題，有待進一步研究，這些問題主要包括：1) 脂肪酶控制樹脂障礙技術主要應用于磨石磨木漿和熱磨機械漿，對于其他漿種例如硫酸鹽漿是否適用有待研究；2) 制漿造紙環(huán)境的溫度和pH較高，脂肪酶并不能發(fā)揮其最佳效果，因此需要篩選出耐高溫耐堿的菌種；3) 與化學制劑相比，使用脂肪酶控制樹脂障礙的成本比較高，可以采用基因工程將產(chǎn)酶基因轉入工程菌中大量產(chǎn)酶，從而降低成本。

2.2 甾醇酯酶

2.2.1 甾醇酯酶控制樹脂障礙反應機理

甾醇酯酶 (Sterol esterse，EC 3.1.1.13) 是一種水解酶，能夠水解紙漿中的甾醇酯 (有些甾醇酯酶也可以水解甘油三酯)，屬于α/β水解酶家族，具有催化三聯(lián)體結構 (由絲氨酸、組氨酸、谷氨酸/天冬氨酸組成)，其催化底物水解的過程可以分為4步：1) 絲氨酸中的羥基氧首先攻擊底物，發(fā)生親核反應，形成酰基-酶復合物；2) 酰基-酶中間體被水解，釋放出脂肪醇；3) 新的酰基-酶中間體的形成；4) 酰基-酶中間體被水解，釋放出脂肪酸以及酶還原為游離態(tài)[27-28]。

曾誠[29]對于來自不同菌種的甾醇酯酶酶學特性進行研究，得出來自金黃桿菌sp.的甾醇酯酶對于不同碳鏈長度脂肪酸膽固醇酯有很好的水解效率，對膽固醇亞油酸酯表現(xiàn)出最強的酶活性，具有廣泛的底物譜寬。Calero-Rueda等[30]采用來自線嘴殼菌的甾醇酯酶分別處理甾醇酯和甘油三酯，測定其米氏常數(shù)和反應速率常數(shù)分別在0.9–1.1 mmol/L和70–300/s范圍之內(nèi)，說明了甾醇酯酶與底物具有很好的結合能力。另外，一些脂肪酶也具有水解甾醇酯的能力，Kontkanen等[31]發(fā)現(xiàn)來自皺褶假絲酵母菌、染色粘性菌的脂肪酶能夠水解甾醇酯。

2.2.2 甾醇酯酶控制樹脂障礙的工藝

影響甾醇酯酶控制樹脂障礙效果的因素主要包括酶種、酶用量、pH、溫度、時間等。甾醇酯酶控制樹脂障礙的工藝條件及處理效果見表3。

2.2.3 甾醇酯酶控制樹脂障礙技術存在的主要問題

目前，甾醇酯酶用于控制樹脂障礙仍然處于實驗室研究的起步階段，存在較多的問題有待研究解決：1) 甾醇酯酶的水解產(chǎn)物仍然具有較強的黏性，容易形成樹脂沉積，如何將水解產(chǎn)物降解或者分散有待解決；2) 影響甾醇酯酶處理效果的因素仍需進一步研究；3) 根據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn)，有些甾醇酯酶具有水解甘油三酯的活性，那么甾醇酯酶是否可以替代脂肪酶而應用于樹脂障礙的控制有待研究。

2.3 漆酶

2.3.1 漆酶控制樹脂障礙反應機理

漆酶 (Laccase，EC 1.10.3.2) 是一種含銅的多酚氧化酶，可以通過活性位點的銅離子和底物之間的電子傳遞實現(xiàn)對底物的催化氧化，主要作用于紙漿中脂肪酸、樹脂酸、甾醇、甾醇酯等不飽和脂類物質(zhì)。漆酶的氧化還原電位低 (0.5–0.8 V)，只能氧化酚醛類木質(zhì)素結構。而低分子量介體的出現(xiàn)擴大了漆酶的作用范圍，例如2-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 (ABTS)、1-羥基苯并三唑 (HBT)，其原因在于介體提高了漆酶的氧化還原電勢并且減少了漆酶與底物之間的空間阻礙[34]。漆酶-介體系統(tǒng)的催化過程如圖2所示，可以分為2步：1) 在分子氧作為氧化劑的條件下，漆酶將介體氧化為具有高氧化還原電位的穩(wěn)定中間體；2) 氧化介質(zhì)被底物還原[35-36]。

表3 甾醇酯酶在不同實驗條件下的處理效果

圖2 漆酶-介體反應機制[36]

2.3.2 漆酶控制樹脂障礙的工藝

影響漆酶控制樹脂障礙效果的主要因素包括酶種、酶用量、介體的種類及用量、pH、溫度、時間以及漿濃。漆酶控制樹脂障礙的工藝條件及處理效果見表4。

研究發(fā)現(xiàn)，無論是采用合成介體還是天然介體，漆酶-介體系統(tǒng)均可以很大程度上去除紙漿中的親脂性物質(zhì)和木素，提高了紙漿的白度。雖然天然介體在改善紙張性能方面不及人工介體的作用效果，但是可以減輕紙漿粘度的損失[41]。

表4 漆酶在不同實驗條件下的處理效果

2.3.3 漆酶控制樹脂障礙技術存在的主要問題

目前，漆酶-介體系統(tǒng)處理仍處于實驗室研究階段，尚存在一些問題有待研究：1) 大多數(shù)漆酶最適pH值為酸性，而造紙過程一般處于堿性環(huán)境，漆酶不能發(fā)揮最大的氧化效果，因此需要篩選出抗堿性的漆酶菌種；2) 漆酶能夠氧化紙漿中的樹脂，其反應產(chǎn)物主要為醛、酮和環(huán)氧類物質(zhì)，但是缺乏對于反應產(chǎn)物性質(zhì)的探究，不能確定產(chǎn)物是否仍然具有沉積的趨勢；3) 目前，用于樹脂控制的人工介體對環(huán)境有不利影響，因此需要開發(fā)更多的環(huán)境兼容性好的介體；4) 漆酶生產(chǎn)成本比較高，因此需要采用基因工程、酶工程等篩選出產(chǎn)酶量多、穩(wěn)定性好的漆酶菌種。

2.4 脂氧合酶

2.4.1 脂氧合酶控制樹脂障礙反應機理

脂氧合酶 (Lipoxygenase, EC1.13.11.12) 是一類催化不飽和脂肪酸及其酯氧化的含鐵氧化還原酶，能催化具有順,順-1,4-戊二烯結構的不飽和脂肪酸加氧反應，生成具有共軛雙鍵的不飽和酸的氫過氧化物[42]。一般來說，脂氧合酶氧化降解脂肪酸的過程可以分為2步，即底物活化和氧加成：1) 酶中的Fe3+從脂肪酸中的烯丙基結構得到一個電子，產(chǎn)生自由基和Fe2+；2) 分子氧與自由基反應形成氫過氧化物 (圖3)，而氫過氧化物可以被金屬離子分解形成更小的碎片，從而進一步降低氧化產(chǎn)物的黏性[43]。

2.4.2 脂氧合酶控制樹脂障礙的工藝

影響脂氧合酶控制樹脂障礙效果的因素主要包括酶種、酶用量、介體的用量、溫度、處理時間、pH、漿濃。脂氧合酶控制樹脂障礙的工藝條件及處理效果見表5。

2.4.3 脂氧合酶控制樹脂障礙技術存在的主要問題

針對脂氧合酶處理樹脂障礙研究現(xiàn)狀，仍然有幾點需要關注：1) 脂氧合酶氧化效果不及漆酶，如何提高脂氧合酶氧化活性有待研究；2) 脂氧合酶的介體比較單一，只有亞油酸，需要探究不同的介體。

圖3 脂氧合酶參與的脂質(zhì)加氧反應[44]

表5 脂氧合酶在不同實驗條件下的處理效果

2.5 其他酶的作用以及酶的復配

除了脂肪酶、甾醇酯酶、漆酶以及脂氧合酶可以直接作用于樹脂外，其他酶也可以起到輔助的作用。木聚糖酶可以催化降解纖維細胞壁上的木聚糖，因為樹脂容易與木聚糖等碳水化合物聚集，導致部分樹脂隨著木聚糖的降解而被除去[46]。蛋白酶可以使樹脂松散地附著在纖維上，提高了脂肪酶、漆酶等對于紙漿中樹脂的降解效果。

由于酶的專一性，只能針對一種或者是一類物質(zhì)發(fā)生反應。兩種或者兩種以上的酶協(xié)同作用可以克服單一酶種的局限性。例如：脂肪酶和脂氧合酶復配，脂肪酶可以有效地降解甘油三酯，而且其水解產(chǎn)物對于脂氧合酶氧化反應具有促進作用；脂肪酶或者甾醇酯酶與漆酶復配，可以有效地除去脂肪酶或者甾醇酯酶的水解產(chǎn)物。

目前，酶復配控制紙漿樹脂障礙并未實現(xiàn)工廠化的應用，主要原因如下：1) 該技術開發(fā)的研究內(nèi)容多、難度大、需要時間；2) 隨著原料的種類、產(chǎn)地、貯存時間、制漿方法、漂白方法等不同，各種紙漿中樹脂的組成差別很大；3) 紙漿中樹脂的成分復雜，這些成分分別采用什么酶處理比較合適、用哪些酶復配等問題還需要進行大量的研究；4) 該領域?qū)儆趯W科交叉，需要生物技術進步來提升酶的性能，并降低應用成本。

3 展望

盡管生物酶用于控制樹脂障礙具有催化效率高、環(huán)境兼容性好等許多優(yōu)點，并已在生產(chǎn)上得到了應用，如脂肪酶用于控制甘油三酯含量較高的針葉木機械漿的樹脂障礙已在生產(chǎn)上取得了良好的效果。由于紙漿中樹脂的組成復雜，不同原料和不同制漿方法生產(chǎn)的紙漿中樹脂的組成不同；而生物酶催化降解紙漿中樹脂具有很強的專一性，同時這些生化反應研究的難度大，因此，目前生物酶控制紙漿樹脂技術開發(fā)還存在很多亟待解決的問題，比如對于樹脂主要成分不同的其他原料、其他漿種的樹脂控制則需要根據(jù)其樹脂的成分不同進一步研究脂肪酶和其他酶的復配；甾醇酯酶可水解闊葉木漿中含量較高的甾醇酯，但其水解產(chǎn)物仍然具有較強的黏性，如何將水解產(chǎn)物進一步降解仍有待解決；漆酶能夠氧化紙漿樹脂中不飽和脂類物質(zhì)，而且天然介體的開發(fā)為其控制樹脂障礙的產(chǎn)業(yè)化應用創(chuàng)造了良好的條件，但漆酶的生產(chǎn)成本較高。隨著這些問題的逐步解決，用生物酶控制紙漿中樹脂障礙和膠粘物的技術將不斷完善，并在制漿造紙工業(yè)中得到更多的推廣應用。

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Progress in pitch control in pulp by enzymes

Tingting Meng1, Lefan Ma1, and Hongbing Li2

1 School of Chemistry and Biological Engineering, Changsha University of Science & Technology, Changsha 410114, Hunan, China 2 Hunan Hong Ying Biotech Co., LTD, Changde 415400, Hunan, China

Pitch deposits have negative effects on product quality, machine performance and production line profitability during pulp and paper manufacture. As traditional pitch control technology cannot provide satisfactory solutions in the pitch deposits, the enzymatic treatment has been rapidly developed for its high efficiency and pollution-free property. In this review, the chemical composition and present form of the pitch in pulp is first introduced, followed by a description of the pitch control enzymes. The emphasis is on the current research on enzymatic solutions to pitch problems, including the reaction mechanism, technology, and the present main problems of lipase, sterol esterases, laccase and lipoxygenase. Finally, the technology prospects in this field are proposed.

pitch, lipase, sterol esterse, laccase, lipoxygenase

April 17, 2018;

August 13, 2018

Major Science and Technology Special Project in Hunan Province (No. 2013FJ1012).

Lefan Ma. Tel: +86-731-85258733; E-mail: mlf1001@126.com

湖南省科技重大專項 (No. 2013FJ1012) 資助。

2018-08-28

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180827.0954.001.html

10.13345/j.cjb.180145

(本文責編 陳宏宇)