PCV2b Cap蛋白重組桿狀病毒的構建及鑒定

劉喜鳳 黃丹丹 張學賢

（1.北京大北農科技集團股份有限公司動物醫學研究中心 北京 102609；2.北京市畜禽生物制品工程技術研究中心 北京 102609）

豬圓環病毒（Porcine circovirus，PCV）是迄今發現的最小的一種動物病毒[1]，純化后的PCV樣品，電鏡觀察為17 nm無囊膜的球狀病毒粒子。PCV基因組為單股負鏈環狀DNA，基因組非常小，PCV有2種血清型，PCV1和PCV2，兩種血清型毒株之間的序列同源性低于80%[2]。PCV2毒株可分為PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d[3]，2003年之前，PCV2a為臨床感染的豬群中最為流行的基因型，2003年之后則以PCV2b為主。PCV1基因組全長為1 559 bp，PCV2全長為1 767 bp或1 768 bp，主要編碼3個蛋白，ORF1編碼非結構復制蛋白Rep，大小為314個氨基酸，ORF2編碼病毒核衣殼蛋白Cap，是唯一的結構蛋白，大小為233～234個氨基酸，是主要的免疫原性蛋白，可以自我組裝成病毒粒子，ORF3與ORF1重疊，編碼大小為105個氨基酸的非結構蛋白。PCV1無致病性，PCV2感染可引起幾種綜合征和疾病，包括斷乳仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎與腎病綜合征（PDNS）、繁殖障礙、豬呼吸綜合征等，給世界養豬業帶來巨大的損失[4]。

昆蟲桿狀病毒表達系統（Baculovirus expression system，BEVS）是一種高效的真核表達系統，能有效進行蛋白質的翻譯后加工，表達產物的生物學活性與天然蛋白十分接近，特別適合于真核蛋白的制備研究，已成功表達了多種功能蛋白[5]。

本試驗按照昆蟲細胞密碼子優化合成PCV2b ORF2編碼的Cap蛋白基因序列，通過分子克隆的方法將該序列連接到改造過的桿狀病毒載體PMP10-Fastdual中，構建表達PCV2b Cap蛋白的重組桿狀病毒載體PM-P10-Fastdual-2b，通過桿粒制備、sf9細胞轉染，篩選到表達PCV2b Cap蛋白的重組桿狀病毒株，IFA、SDS-PAGE及Western-blotting結果都表明，PCV2b Cap蛋白獲得成功表達，為開發豬圓環PCV2b亞單位疫苗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 PM-P10-Fastdual質粒、DH10Bac感受態和sf9細胞為大北農（大興）科技園保存；質粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；限制性內切酶購自NEB公司，高保真DNA聚合酶購自Takara公司。DNAMarker Trans2K○RPlus II DNA Marker和蛋白Marker Blue Plus II Protein Marker（14-120 kDa）購買自北京全式金生物技術有限公司，昆蟲細胞培養基（Sf-900TMIII SFM/Grace's Medium）購自Thermo公司，FuGENE6 Transfection購自Promega公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗豬IgG購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗流程 試驗按圖1流程進行。

1.2.2 序列合成 根據GenBank公布的PCV2 Cap蛋白序列（ACN59889），按照昆蟲細胞密碼子偏愛性對2b-Cap基因進行優化和合成，通過酶切連接的方法將該基因連接到實驗室保存的昆蟲細胞高表達載體PM-P10-Fastdual中，構建高表達PCV2b Cap蛋白的昆蟲細胞表達載體PM-P10-Fastdual-2b。

1.2.3 PM-P10-Fastdual-2b質粒構建和驗證 將合成的720 bp 2b-Cap基因序列（兩端帶有XhoⅠ和KpnⅠ酶切位點）以及PM-P10-Fastdual載體XhoⅠ和KpnⅠ雙切，回收2b-Cap和PM-P10-Fastdual雙切片段，連接構建PM-P10-Fastdual-2b表達載體，大小為8 715 bp，該載體圖譜見圖2。試驗通過測序及設計引物擴增2b-Cap序列，通過XhoⅠ和KpnⅠ雙切PM-P10-Fastdual-2b來驗證該質粒是否構建正確。

圖2 PM-P10-Fastdual-2b質粒圖譜

圖1 試驗流程圖

1.2.4 重組rBacmid-2b構建和鑒定 按照Bac-to-Bac Baculovirus Expression Syste表達系統操作說明，將驗證正確的重組桿狀病毒質粒PM-P10-Fastdual-2b轉化感受態細胞DH10Bac，如圖3所示，在DH10Bac細胞中，重組轉移載體PM-P10-Fastdual-2b與Bacmid發生位點特異性的轉座作用，經藍白菌落篩選及利用通用引物進行PCR鑒定，獲得含2b-Cap基因序列的重組病毒桿粒rBacmid-2b。前取混懸液、離心后取上清、細胞重懸液制樣，進行SDS-PAGE電泳，轉印到硝酸纖維素膜上，5%脫脂乳封閉過夜，加入1：100稀釋的豬圓環病毒陽性血清，室溫孵育1 h，PBST洗滌3次，加入1：5 000稀釋的HRP標記的山羊抗豬IgG，室溫孵育1 h，洗滌3次后，加入化學發光顯色液進行顯色。

2 結果和討論

2.1 PM-P10-Fastdual-2b質粒構建和鑒定 按照

圖3 Bacmid位點特異性轉座示意圖

1.2.5 重組桿狀病毒的獲得與病毒擴增 按照Lipofectamine 2000轉染試劑的說明操作，將重組穿梭載體rBacmid-2b轉染對數生長期的sf9細胞，27℃靜置培養，轉染后72 h收毒，500 g離心5 min，移取上清于干凈的EP管中，4℃避光保存，即P1病毒RAC-2bCap。將P1代RAC-2bCap按1：10的體積比感染處于對數生長期的sf9細胞，27℃培養2～3 d至細胞出現明顯病變時，凍融2次，500 g離心5 min，去除細胞和大的細胞碎片，收集上清4℃避光保存，即為第2代病毒，P1代RAC-2bCap，用同樣的方法獲得第3代病毒，P3代RAC-2bCap毒。

1.2.6 間接免疫熒光（IFA）鑒定2b-Cap蛋白表達六孔板接毒，72 h后吸棄培養基，PBS洗板3次，每次洗5 min；80%丙酮固定液加入孔中，每孔2 mL，4℃固定30 min；PBS洗板3次，每次洗5 min；PCV2陽性豬血清用PBS按1∶200稀釋，37℃孵育1 h；PBS洗板3次，每次洗5 min；FITC-山羊抗豬IgG用PBS按1∶100稀釋，37℃避光孵育1 h；PBS洗板3次，每次洗5 min；熒光顯微鏡觀察。

1.2.7 SDS-PAGE及Western-blotting鑒定2b-Cap蛋白表達 將P3代RAC-2bCap重組桿狀病毒按1：50體積比接種對數生長期的sf9細胞，分別于24 h、48 h、72 h、96 h取樣，感染96 h收毒，樣品于2 000 r/min離心5 min，移取上清于干凈的EP管中，細胞沉淀用等體積PBS重懸。分別于72 h收毒

1.2.2和1.2.3試驗方法進行質粒構建。設計引物擴增2b-Cap序列。從圖4的電泳結果可以看出，擴增的2b-Cap序列電泳位置與預期一致大小為720 bp左右。從圖5可見，XhoⅠ/KpnⅠ雙切得到兩條帶，上面條帶是載體序列，下面條帶是2b-Cap序列，結果與預期條帶大小一致，同時測序結果（略）也證明2b-Cap序列已經成功插入到目的載體中，質粒PMP10-Fastdual-2b構建正確。

圖4 PM-P10-Fastdual-2b質粒PCR驗證

2.2 重組Bacmid-2b構建和鑒定 按照1.2.4的方法構建重組rBacmid-2b，挑選3個白斑和1個藍斑進行鑒定，引物為M13上下游引物。由圖6的結果可見，挑取的3個白斑，經純化后，菌落PCR大小為6 000 bp左右，與預期一致，因此，挑取的3個克隆均為陽性。純化后的單克隆菌液PCR條帶單一，沒有野毒條帶污染，桿粒制備成功。

圖5 PM-P10-Fastdual-2b質粒酶切驗證

圖6 重組桿粒PCR鑒定

2.3 重組病毒的獲得與IFA鑒定 試驗選取純化后的2個單克隆轉接至6 mL三抗LB培養基，37℃、220 r/min培養24 h，用異丙醇沉淀法提取重組桿粒并純化，隨后按照1.2.5的方法轉染sf9細胞，收獲P1代病毒。病毒傳代，按照1.2.6的方法對P2代RAC-2bCap毒進行IFA鑒定。由圖7可見，P2代重組病毒相比空白細胞有明顯的綠色熒光，初步驗證b2-Cap蛋白表達。

2.4 重組蛋白表達鑒定

2.4.1 SDS-PAGE鑒定 按照1.2.7的方法步驟，接種量為0.1 MOI，分別于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h取混懸液，離心后取上清、細胞重懸液制樣，進行SDS-PAGE電泳。從圖9的SDS-PAGE電泳圖譜可以看出，2b-Cap蛋白在細胞沉淀中得到表達，且隨著時間蛋白表達有增長的趨勢，表達量可達300μg/mL左右，但是該蛋白為不可溶表達，沒有分泌到上清中，蛋白大小為28 kD左右。

圖7 IFA鑒定重組病毒

圖8 SDS-PAGE驗證2b表達

2.4.2 Western-blotting鑒定2b-Cap表達 SDSPAGE電泳圖譜證明2b-Cap得到表達，為了進一步證實該蛋白為2b-Cap蛋白，對樣品進行了Western-blotting分析，試驗按照1.2.7的方法進行。由Western-blotting結果可見，24 h、48 h、72 h、96 h時2b-Cap蛋白都有表達，條帶大小為2 828 kD左右，且隨著培養時間延長，蛋白表達 量增加，證明2b-Cap蛋白在重組桿狀病毒中得到表達。

3 結果和討論

圖9 2b-Cap蛋白的Western-blotting驗證

桿狀病毒表達系統表達外源蛋白用于疫苗生產已經非常成熟，其可以進行大規模的表達生產，生產的重組蛋白產量高，蛋白翻譯后加工比細菌、酵母生產系統完善，而且由于昆蟲桿狀病毒具有限制性的宿主范圍，只對特定種屬的昆蟲及其細胞進行感染，對人畜等脊椎動物沒有感染能力，因此，具有比在哺乳動物及其培養細胞生產系統更為安全等優點而成為目前最有效的真核表達系統之一。但是外源蛋白的表達量依據培養條件、細胞狀態種類、培養基的質量以及外源基因本身的性質，有著很大差別。本單位先前利用商品化的pFastBacTMDual作為載體表達PCV2b的Cap蛋白，蛋白表達量非常低，無法滿足后續的試驗需求，因此，本試驗根據昆蟲密碼子優化合成了PCV2b的Cap基因，同時構建了添加增強子序列的PM-P10-Fastdual載體，通過分子克隆的方

法構建了重組桿狀病毒PCV2b Cap蛋白高表達載體PM-P10-Fastdual-2b，通過桿粒制備及轉染sf9昆蟲細胞獲得了表達豬PCV2b Cap蛋白的重組桿狀病毒株，IFA、SDS-PAGE及WB驗證該毒株可以表達PCV2b Cap蛋白，該蛋白以胞內沉淀形式表達，但是表達量明顯提高。該試驗為下一步制備PCV2b Cap蛋白亞單位疫苗打下了基礎。