H9亞型HP株禽流感病毒繁殖規律的探索

陳慧婧 福州大北農生物技術有限公司 福州 350014

禽流感（Avian Influenza，AI）是由禽流感病毒引起雞、火雞、鴨、鵪鶉和鵝及水禽、野鳥等患病的傳染性疾病，禽流感又被稱為真性雞瘟或歐洲雞瘟[1-2]。1978年，意大利首次報道了該病的出現[3]，直到1955年證明雞流感病毒含有甲型流感病毒的核蛋白，該病是由A型流感病毒引起[4]。感染禽流感病毒后，感染動物臨床癥狀表現為：從無癥狀低致病力禽流感到中等致病力呼吸道癥狀，直至高致病性禽流感引起的烈性死亡[5-7]。因此，被國際獸醫局列為A類傳染病。

禽流感成為危害養殖業的首要疫病，并引起世界范圍的高度重視。據調查發現在我國大部分禽群中流行的禽流感毒株主要是H9和H5亞型[8-9]。由于H9亞型屬于低致病率、低致死率的禽流感病毒，因此，養殖戶不夠重視，但該病毒可一直存在于禽群中，引起輕微呼吸道癥狀，產蛋率下降，肉質下降，H9亞型病毒的暴發依然給養禽業帶來不可估計的經濟損失[10-11]。疫苗免疫是預防禽流感的重要措施和有效途徑。為防止高致病性禽流感再次發生，我國采取了對家禽廣泛接種滅活疫苗等措施，收到了很好的效果[12-14]。由于生產中利用SPF雞胚培養病毒的成本高，而非免雞胚的培養也能獲取較純的病毒，同時價格較低，故本研究用H9亞型HP株接種非免雞胚，并對不同死亡時間段的尿囊液效價進行測定，以期探索該毒株在非免雞胚中的繁殖規律，得出雞胚的最佳培養時間和尿囊液收獲時間，最大限度提高單位體積尿囊液中的病毒含量，為制備高效疫苗提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 禽流感病毒（H9亞型HP株）種毒代次F2，批號DZ20140306，由福州大北農生物技術有限公司提供。

1.1.2 試驗動物 非免雞胚，由揚州康威提供，福州大北農生物技術有限公司進行孵化至10日齡。SPF雞胚，山東濟南斯帕法斯SPF雞場提供，由福州大北農生物技術有限公司進行孵化至10日齡。

1.1.3 主要試劑 生理鹽水、1萬IU/mL青霉素鏈霉素溶液、1%雞紅細胞懸液，均由福州大北農生物技術有限公司配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 禽流感病毒繁殖

1.2.1.1 照蛋、畫蛋 非免疫蛋置于38～39℃、濕度50%～65%的孵化器內孵化至10日齡，照蛋剔除無精蛋和死胚。在雞胚胎一側畫出氣室邊緣線，在大血管上方的氣室邊緣畫一個小圓圈，即為接種部位。

1.2.1.2 接種 取生產用禽流感種毒DZ20140306，用滅菌生理鹽水稀釋至10-4～10-5，并加青霉素、鏈霉素100～200 IU/mL。每胚尿囊腔內接種0.1 mL稀釋好的種毒，共接種1 000枚非免雞胚，接種后密封針孔。

1.2.1.3 孵育、觀察與收獲 雞胚接種后，將1 000枚雞胚氣室向上置36～37℃、濕度為60%左右的溫室內繼續孵化，使病毒在雞胚內增殖，期間不必翻蛋。雞胚接種后，24 h照蛋一次，將24 h時照蛋死亡的雞胚棄去不用。之后需要每6 h照蛋一次，死亡雞胚隨時取出置于2～8℃冷庫保存，并記錄各時間段死亡雞胚數量；直至120 h，取出所有的胚，置于2～8℃冷卻12～24 h后，分別收獲各時間段（30 h、36 h、42 h、48 h、54 h、60 h、66 h、72 h、78 h、84 h、90 h、96 h、102 h、108 h、114 h、120 h）死亡雞胚尿囊液。

1.2.2 病毒含量測定

1.2.2.1 稀釋、接種 取9支滅菌試管，將試管依次編號為-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9，每管加生理鹽水9.0 mL。從被檢樣品中吸取1.0 mL加入第1管，混勻后從第1管中吸取1.0 mL加入第2管，同法依次做10倍系列稀釋至第9管。稀釋完成后按10-9、10-8、10-7稀釋滴度順序，每個稀釋滴度接種SPF雞胚（10日齡）5個，尿囊腔接種，每胚接種0.1 mL，接種完成后用石蠟封口，并置37℃繼續培養。

1.2.2.2 照蛋 SPF雞胚培養至24 h開始照蛋，之后每6 h照蛋1次，48 h以前死亡的雞胚棄去不計，培養至120 h。死亡雞胚取出，記錄死亡時間后置2～8℃冰箱保存。120 h后將剩余活胚取出，室溫放置15～30 min后再放入2～8℃冰箱。將48～120 h死亡的雞胚及活胚逐個收獲尿囊液，進行血凝價測定。凝集價≥1：16（微量法）者判為感染，計算EID50。

2 結 果

雞胚接種禽流感種毒后，不同時間段死亡數量見表1，不同時間段死亡的雞胚尿囊液效價見表2。雞胚在60 h前死亡數量不多，在60～84 h每次照蛋死亡數量都超過了接種數量的10%，死亡比較集中在60～84 h。尿囊液效價隨著培養時間逐步升高，最開始24 h只有108.17EID50/mL，隨后病毒大量繁殖，在54～96 h效價達109.5EID50/mL及以上，最高時達109.63EID50/mL。

3 討 論

禽流感（H9亞型HP株）滅活疫苗的抗原生產主要原材料是雞胚，而雞胚又分為SPF雞胚、非免疫雞胚和普通雞胚。SPF雞胚無特定病原體，增殖病毒滴度高，但是成本較高，在滅活苗的大生產中使用SPF雞胚不太現實。而普通雞胚因為雞群頻繁接種疫苗，使雞體內有較高的抗體水平，所以，普通種蛋存在的母源抗體影響病毒的繁殖，在疫苗生產中也不可取。而非免疫雞胚的價格相對于SPF雞胚較為低廉，而且沒有接種病毒的母源抗體，對病毒繁殖影響不大，在滅活疫苗生產中使用廣泛。病毒含量高低直接影響疫苗的免疫效果，掌握最佳的培養及收獲時間，最大限度提高單位體積尿囊液中的病毒含量在疫苗生產中尤為重要。

本試驗著重從禽流感病毒接種后雞胚死亡時間和不同死亡時間的病毒滴度兩個方面進行，發現感染后非免雞胚死亡數量占接種雞胚總數的80%以上。死亡雞胚尿囊液病毒檢測結果表明，禽流感H9亞型HP株接種非免雞胚后，雞胚死亡高峰期出現在60～84 h，該時段病毒的滴度也處于病毒繁殖的高峰期，最高達到109.63EID50/mL；直到96 h病毒仍維持較高的水平，為109.50EID50/mL，而96 h后病毒滴度開始衰減，所以，H9亞型HP株禽流感病毒最佳培養時間為96 h。

表1 不同時間段（非免）雞胚死亡數量

表2 不同死亡時間雞胚尿囊液病毒含量