無(wú)抗日糧背景下對(duì)四種常見益生菌制劑的評(píng)估

◆作者：魏可健 舒丹平 周琪琪 曾得壽 譚現(xiàn)義 劉緒同 劉煬

◆單位：深圳市金新農(nóng)科技股份有限公司，深圳，518106

幾十年來(lái)，抗生素已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)，據(jù)報(bào)道，中國(guó)抗生素的使用量和排放量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，其中動(dòng)物用抗生素占總量的52%。由于大量使用抗生素引發(fā)了藥物殘留、抗生素耐藥性、環(huán)境污染等問題，歐盟委員會(huì)于2006年已禁止在飼料中添加抗生素作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑。美國(guó)也在消費(fèi)者壓力的推動(dòng)下逐漸淘汰促生長(zhǎng)用抗生素的使用（Castannon，2007）。隨著禁抗的步伐不斷加速，研究探索新的抗生素替代品已成為迫在眉睫的需求。

益生菌制劑是一種含有單一或混合活菌的添加劑，當(dāng)攝入有效劑量的益生菌制劑會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有益的作用。益生菌廣泛用于食品行業(yè)和動(dòng)物生產(chǎn)中，其主要成分活菌能夠在腸道內(nèi)定植，抑制有害菌的生長(zhǎng)繁殖，促進(jìn)腸道的微生態(tài)平衡。其代謝產(chǎn)物還能夠調(diào)節(jié)腸道免疫，維持腸道的正常功能，使機(jī)體的免疫能力增強(qiáng)，提高腸道對(duì)食物的消化率。已發(fā)表的研究結(jié)果表明益生菌對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的促進(jìn)作用存在較大的差異，可能是由于益生菌的使用劑量、益生菌類型、使用時(shí)間、飼料穩(wěn)定性及理化性質(zhì)和養(yǎng)殖管理等因素的影響。在商業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用的益生菌制劑有:乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、乳球菌屬、酵母菌屬和芽孢桿菌屬。其中芽孢桿菌屬、腸球菌屬和酵母菌屬是動(dòng)物養(yǎng)殖中使用最普遍的益生菌屬。（Ferreira等，2011）由于益生菌制劑含有活菌的屬性，進(jìn)入動(dòng)物體消化道的過程中會(huì)被各種消化液作用而部分失活。且益生菌不能耐受過高的溫度，這也使得其在飼料生產(chǎn)中受到制約。因此，了解常見的益生菌制劑的生物活性對(duì)飼料生產(chǎn)領(lǐng)域具有重要的參考價(jià)值。試驗(yàn)通過研究四種常見益生菌的耐高溫能力、耐胃酸和膽鹽能力和抑菌性，以求為更好地發(fā)揮益生菌制劑在飼料工業(yè)中的作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 益生菌制劑

益生菌制劑包括枯草芽孢桿菌（≥1×1010CFU/mg）、地衣芽孢桿菌（≥1×1010CFU/mg）、丁酸梭菌（≥1.5×1010CFU/mg）和屎腸球菌（≥3×109CFU/mg）。

1.1.2 指示菌

大腸桿菌ATCC25922；沙門氏菌ATCC14028；產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB固態(tài)培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物 5g，氯化鈉 10g，瓊脂粉15g，加入1000mL H2O完全溶解后，調(diào)pH值至7.3±0.1，121℃滅菌20min。脫脂乳培養(yǎng)基：脫脂乳粉10g，蒸餾水100ml，經(jīng)過115℃高壓蒸汽滅菌15min。

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉 3.0g，NaCl 5.0g，蒸餾水1000mL，調(diào)節(jié)pH 7.4±0.2，經(jīng)過121℃高壓蒸汽滅菌15min。

RCM培養(yǎng)基：牛肉浸出粉1.0g，胨 1.0g，酵母浸出粉 0.3g，可溶性淀粉0.1 g，葡萄糖0.5 g，鹽酸半胱氨酸 0.05g，NaCl 0.5g，乙酸鈉0.3g，瓊脂0.05g，蒸餾水100mL，調(diào)節(jié) pH 6.8±0.2，經(jīng)過121℃高壓蒸汽滅菌15min。

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：胰蛋白胨 5.0g，酵母浸粉 2.5g，葡萄糖 1.0g，瓊脂 15.0g。

LB固體培養(yǎng)基：氯化鈉1g、蛋白胨1g、酵母浸提物0.5g、瓊脂粉1.5g、水100ml。調(diào)pH值為7.0±0.2。121℃，高壓 滅 菌15min，滅菌后可放置在80℃的水浴鍋或者烘箱中保溫。

蒸餾水1000mL，調(diào)節(jié)pH 7.0士0.2，經(jīng)過121℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.4 試驗(yàn)器材

移液槍（槍頭）、牛津杯、培養(yǎng)皿、離心管、酒精燈、止血鉗、超凈工作臺(tái)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)、自動(dòng)pH測(cè)定儀、高壓滅菌鍋、天平、滅菌器、培養(yǎng)皿、試管、燒杯、量筒、酒精燈、牛津杯。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高溫耐受性試驗(yàn)

①菌液的制備：分別稱取1g樣品加入10 mL無(wú)菌水，震蕩混勻，備用。

②試驗(yàn)方法：用平板計(jì)數(shù)法分別對(duì)四種益生菌制劑的起始菌液濃度進(jìn)行計(jì)數(shù)。且按1%劑量將菌液加入含有80%甘油和20%無(wú)菌水的混合液，將處理液置于85℃的水浴鍋，水浴5 min。水浴結(jié)束，使用平板計(jì)數(shù)法對(duì)水浴處理后的菌液濃度進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.2 胃酸和膽鹽耐受性試驗(yàn)

①配置模擬胃液：用10M HCl將無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)至pH=2.5，每100mL液體加入1g胃蛋白酶，混勻，用0.20μm的無(wú)菌濾頭過濾待用。

②配置模擬小腸液：用10M HCl將無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)至pH=6.8，每100 mL液體加入1 g胰蛋白酶、0.3 g膽鹽，混勻，用0.20 μm的無(wú)菌濾頭過濾待用。

③試驗(yàn)方法：按1%劑量將1.2.1中制備好的菌液加入10 mL模擬胃液中，于37℃水浴1h。在6000r/min條件下離心6min，去上清液，加入10mL無(wú)菌生理鹽水重懸，此步驟重復(fù)三次。將重懸后的菌液在6000rpm條件下離心6min，去上清液。加入10 mL制備好的模擬小腸液，于37℃水浴2h。水浴結(jié)束，使用平板計(jì)數(shù)法對(duì)處理后的菌液濃度進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.3 牛津杯抑菌試驗(yàn)

①菌種的活化：大腸桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌為指示菌。分別對(duì)四種益生菌制劑和三種指示菌進(jìn)行劃線培養(yǎng)，挑取單菌落加入對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增，于37℃培養(yǎng)48 h（丁酸梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌在厭氧罐中培養(yǎng)），備用。

②固體培養(yǎng)基的配置：在已滅菌的培養(yǎng)皿中倒入15 mL LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行封底。待第一層培養(yǎng)基凝固。待LB固體培養(yǎng)基放置到不燙手后，每100mL LB固體培養(yǎng)基中，加入100uL菌液，混勻。倒入之前配置好的已經(jīng)凝固的培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)基倒入5mL。

③試驗(yàn)方法：將牛津杯放置于培養(yǎng)基5～10min后，待培養(yǎng)基凝固，用止血鉗取出牛津杯，在培養(yǎng)皿底部寫好記號(hào)，對(duì)應(yīng)沿圓環(huán)外壁均勻加入10uL樣品溶液，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h（丁酸梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌在厭氧罐中培養(yǎng)）。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 高溫的耐受性試驗(yàn)

由表1可知，地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌對(duì)高溫均有較高的耐受性，在85℃水浴5 min后細(xì)菌存活率均高于80%。而屎腸球菌對(duì)高溫的耐受能力較弱，經(jīng)過高溫水浴后存活率僅不到5%。

表1 益生菌制劑對(duì)高溫的耐受性

表2 益生菌對(duì)胃酸和膽鹽的耐受性

2.2 胃酸和膽鹽的耐受性試驗(yàn)

由表2可知，經(jīng)過處理后的枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌的存活率均大于90%，試驗(yàn)表明枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌對(duì)胃酸和膽鹽的耐受力較強(qiáng)。地衣芽孢桿菌對(duì)胃酸和膽鹽的耐受能力相較枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌稍弱，但強(qiáng)于屎腸球菌，細(xì)菌存活率達(dá)到72.94%。屎腸球菌經(jīng)過胃酸和膽鹽處理后細(xì)菌的細(xì)菌存活率只有30.53%。

2.3 牛津杯抑菌試驗(yàn)

由表3可知，地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌和屎腸球菌對(duì)大腸桿菌均無(wú)抑制作用；地衣芽孢桿菌可以抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)，而枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌對(duì)沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌均沒有抑菌作用。屎腸球菌可以抑制沙門氏菌的生長(zhǎng)，但對(duì)大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌無(wú)抑菌效果。

3 討論

3.1 益生菌制劑對(duì)高溫的耐受性情況

益生菌制劑是一類生物活性添加劑，在畜產(chǎn)品安全和環(huán)境保護(hù)中發(fā)揮重要作用。但由于益生菌制劑的主要功能性物質(zhì)是活菌，在運(yùn)輸、生產(chǎn)和貯存的過程中均存在失活的風(fēng)險(xiǎn)，所以產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定是益生菌制劑存在的主要問題之一（舒娜等，2003）。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌對(duì)高溫均有較好的耐受性，細(xì)菌存活率都達(dá)到80%以上。丁酸梭菌制劑中活菌是以芽孢形式存在的，在高溫環(huán)境具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性；經(jīng)80℃熱處理30 min全部存活，經(jīng)100℃熱處理5 min后30%存活（易中華，2012）。芽孢特殊的生物構(gòu)造及其對(duì)熱應(yīng)激較完善的調(diào)節(jié)機(jī)制使芽孢菌耐熱性較強(qiáng)，與本試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。宋獻(xiàn)藝等（2018）的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)屎腸球菌經(jīng)過80℃熱處理30 min后，存活率僅為17%。經(jīng)過80℃熱處理60min后無(wú)活菌存活。宋（2018）的研究表明屎腸球菌對(duì)高溫的耐受能力較弱，這一結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。試驗(yàn)結(jié)果提示益生菌制劑在飼料加工過程中應(yīng)優(yōu)先選擇對(duì)高溫耐受性較好的芽孢菌。而對(duì)于不耐高溫的益生菌，應(yīng)通過改良加工技術(shù)優(yōu)化其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。

表3益生菌制劑的抑菌作用效果

3.2 益生菌制劑對(duì)胃酸和膽鹽的耐受性情況

益生菌主要在動(dòng)物的腸道中發(fā)揮作用，通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的平衡，增強(qiáng)動(dòng)物免疫能力，維持動(dòng)物的健康狀態(tài)。胃液有強(qiáng)酸性且含有胃蛋白酶，而小腸中膽 鹽 濃 度 達(dá) 到 0.3%（w/v）。（Chou L等，1999）益生菌在消化道中需要經(jīng)歷2 h的低pH胃酸環(huán)境和小腸中高濃度的膽鹽環(huán)境（李善仁等，2010）。低pH條件或疏水條件會(huì)解離益生菌的膜蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡（宋獻(xiàn)藝等，2018）。本試驗(yàn)的結(jié)果表明地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌對(duì)胃酸和膽鹽均表現(xiàn)較好的耐受性，其中枯草芽孢桿菌的對(duì)胃酸和膽鹽的耐受力強(qiáng)于其他三種益生菌制劑，細(xì)菌存活率最高達(dá)到93.74%。李善仁等（2010）的試驗(yàn)中3株枯草芽孢桿菌在0.3%膽鹽處理2 h細(xì)菌存活數(shù)略有下降，無(wú)顯著差異，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。屎腸球菌經(jīng)過胃酸和膽鹽處理后，活菌存活率僅為31.53%，相較于試驗(yàn)中其他三種益生菌制劑耐受能力較弱。丁酸梭菌能夠耐受胃液、膽鹽和消化液（易中華，2012）。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌經(jīng)過1 h模擬胃液處理和2 h模擬小腸液處理后細(xì)菌存活率仍達(dá)到90.03%。試驗(yàn)一定程度可以表明以芽孢形式存在的益生菌制劑經(jīng)過胃腸道更能保證活菌數(shù)量，從而能夠更好地發(fā)揮有益作用。

3.3 益生菌制劑的抑菌效果

抑菌性是益生菌的一個(gè)重要作用。益生菌能夠產(chǎn)生具有抑菌效果的酶類、酸類等生物活性物質(zhì)或通過競(jìng)爭(zhēng)抑制病原菌的生長(zhǎng)（郭志杰等，2010；吳惠芬等，2005）。本試驗(yàn)以沙門氏菌、大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌三種病原微生物作為指示菌驗(yàn)證益生菌制劑的抑菌效果。結(jié)果表明丁酸梭菌對(duì)三種指示菌均無(wú)明顯的抑菌作用。枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌均無(wú)明顯的抑菌作用，但地衣芽孢桿菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌表現(xiàn)出了抑菌效果。但李善仁等（2010）的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三株枯草芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌均表現(xiàn)出來(lái)抑菌作用；張雪平等（2001）的研究表明丁酸梭菌能夠抑制腸內(nèi)致病性大腸桿菌、傷寒沙門氏菌等有害菌的生長(zhǎng)繁殖。益生菌的抑菌效果存在不穩(wěn)定性，同時(shí)菌株或培養(yǎng)環(huán)境的差異、益生菌制劑的加工工藝均會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果，具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。本試驗(yàn)中屎腸球菌對(duì)沙門氏菌具有抑菌作用。Simova等（2009）的研究發(fā)現(xiàn)從乳制品中分離的屎腸球菌在發(fā)酵中產(chǎn)生細(xì)菌素，可以抑制病原微生物的生長(zhǎng)。夏玉等（2014）的研究表明屎腸球菌發(fā)酵乳對(duì)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均有良好的抑制作用，與本試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。

4 結(jié)論

地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌對(duì)高溫、胃酸和膽鹽均有較好的耐受性，而屎腸球菌的耐受能力較弱。

地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌和屎腸球菌對(duì)大腸桿菌均無(wú)抑制作用。屎腸球菌可以抑制沙門氏菌的生長(zhǎng)，地衣芽孢桿菌可以抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)。

參考文獻(xiàn)：（略）