自身免疫性疾病中miRNAs對免疫耐受的調節作用

林 志 高錫強 霍桂桃 張 頔 楊艷偉 呂建軍 李 波 屈 哲

淋巴細胞發育或成熟過程中的調節異常會導致自身免疫性疾病的發生。在中樞免疫耐受中，胸腺細胞發育成熟的重要調節點是依賴于T細胞受體和B細胞受體的信號通路。在周圍免疫耐受中，自身反應性B細胞和T細胞的清除則依賴于恰當的信號通路、細胞凋亡和存活因子、轉錄因子以及效應細胞分化的表觀調控等。此外，Treg細胞的穩態平衡對于限制成熟B細胞以及效應T細胞的激活至關重要[1，2]。所有這些耐受機制中最重要的是蛋白級聯表達中細微的擾動，而多種表觀遺傳學機制參與了這種定量控制，包括微小RNA(miRNAs)的調控[3]。

miRNAs是一類內源性的約21～23個核苷酸的非編碼小分子單鏈RNA分子，它們參與了轉錄后的基因調控。miRNAs通過與靶mRNA的3′端非翻譯區、編碼區或5′端非翻譯區結合，抑制mRNA的翻譯或引發其降解，從而阻遏基因轉錄后的翻譯過程。已證實miRNAs占人類整個基因組的3%，但是卻參與人類基因組中30%以上蛋白編碼基因的轉錄，因此被認為是細胞生命活動中重要的負性調控因子。

免疫系統中miRNAs的變化非常明顯，它們調控了淋巴細胞的發育和成熟。miRNAs的失調會導致多種自身免疫性疾病的發生和發展。研究證實，在人類眾多的自身免疫性疾病，包括紅斑狼瘡、類風濕關節炎和多發性硬化癥中多種miRNAs出現明顯的改變。因此，本文主要探討了miRNAs調節淋巴細胞的發育、成熟，其異常導致的免疫耐受失衡，闡明在自身免疫性疾病中miRNAs的異常造成對淋巴細胞逃脫免疫耐受的分子機制，為自身免疫性疾病的診斷及治療提供潛在的分子標志物以及新的治療靶點。

一、miRNAs對中樞免疫耐受的調控

miRNAs是淋巴細胞發育、成熟關鍵節點的重要調控因子，它們確保中樞免疫系統中淋巴細胞進行正確地重組抗原受體基因，通過TCR或BCR信號通路選擇促使強自身反應細胞發生凋亡。因此，miRNAs的異常會導致TCR或BCR信號通路的失調，從而增加自身反應性淋巴細胞的產生，促使自身免疫性疾病的發生。

研究表明，miRNAs的生物合成途徑是早期B細胞發育的關鍵，Dicer的消失幾乎導致祖B細胞到前B細胞轉變的完全阻滯。祖B細胞重要功能就是BCR基因V(D)J重組，形成功能性的抗原受體。盡管Dicer不能改變V(D)J區重組的基本機制，但是它的確改變了所產生的BCR序列，這表明miRNAs在調節潛在自身反應性B細胞的存活中起著重要的作用。此外，miRNAs17～92簇也證實在B細胞發育中也起著重要的作用。miRNAs17～92簇是由6個miRNAs組成，屬于4個miRNAs家族，即miR-17、miR-18、miR-19、miR-92。BIM是通過PI3K信號通路誘導，并且直接受miRNAs17～92簇靶向調控。一種潛在的PI3K通路的負性調節因子腫瘤抑制因子PTEN也是受miRNAs17～92簇靶向調控。當miRNAs17～92簇從發育中B細胞內敲除后，PTEN和BIM表達升高并出現細胞凋亡，導致B細胞缺乏。相反，miRNAs17～92簇過表達時，將誘導T細胞或B細胞存活率增高，從而促進淋巴組織增生以及自身免疫性疾病的發生[4]。

在胸腺T細胞發育的早期階段，通過新形成的TCR信號為T細胞的發育、成熟提供重要的生存信號，而自身反應性抗原顯示強TCR信號則會誘導凋亡。因此，miRNAs通過調節TCR信號的強弱，促使自身反應性T細胞逃脫清除機制。其中，miRNAs181通過靶向作用于多個蛋白的磷酸化而改變TCR信號的強度，包括PTPN22、SHP-2、DUSP5、DUSP6和PTEN[5]。在胸腺T細胞發育的早期，雙陰性胸腺細胞高表達miRNAs181，促使其對前TCR和TCR信號具有高敏感性。當胸腺細胞成熟進入雙陽T細胞和單陽性T細胞后，miRNAs181的表達下降，在胸腺細胞的陰性和陽性選擇中降低其與TCR結合的敏感度[6]。miRNAs181的異常會導致正常的自身反應性T細胞逃脫TCR信號介導的凋亡。研究證實，急性期和慢性期多發性硬化以及自身免疫性腦脊髓炎患者腦白質中miRNA181a和miRNA181b表達水平顯著性降低[7]。因此，miRNAs181可能是調節T細胞介導的自身免疫性疾病的發生和發展的關鍵。

二、miRNAs對周圍免疫耐受的調控

外周免疫耐受機制可以嚴格限制B細胞產生自身抗體以及自身反應性T細胞造成的組織炎癥和損傷，而這些機制是受到miRNAs的調控。異常的miRNAs可以導致外周淋巴細胞的激活、存活、增生、分化以及具有效應功能，從而誘導自身免疫性疾病的發生。

未成熟B細胞離開骨髓進入外周后完成自身的發育和選擇。耐受缺失以及受體編輯可以消除BCR與外周自身抗原的強烈反應。中度的BCR信號促進邊緣區或過渡性B細胞的產生，而弱BCR信號促進濾泡B細胞的產生。相對于邊緣區和過渡性B細胞，濾泡B細胞中miRNA182和其他幾個miRNAs非常豐富。miRNA185的過度表達可以降低其靶點BCR下游轉導信號激酶BTK的表達[8]。此外，外周B細胞中Dicer的消融也會改變BCR的特征。雌性小鼠成熟B細胞中缺失Dicer會誘發自身抗體的產生以及腎臟免疫復合物的沉積[9]。

近年來的白血病研究表明與自身免疫性疾病相關的BCR下游PI3K信號受到miRNAs的調控[10]。miRNA150的表達與慢性淋巴細胞白血病(CLL)的嚴重程度呈負相關。miRNA150調控靶點是Gab1基因，該基因依賴于BCR刺激可以促使PI3K轉移至胞膜[11]。miRNA34a調控靶點是Foxp1基因，它是PI3K信號的負反饋調節子，抑制B細胞的發育。PTEN被證實是多種miRNAs作用的靶點，在不同類型的免疫細胞具有不同的效應。與CLL進展相關的成熟B細胞的亞型細胞中miRNA22表達增加，它作用于PTEN靶點，導致PI3K活性增加并增殖[12]。研究發現，系統性紅斑狼瘡患者B細胞中miR22、miR7和miR21的增高可誘導PTEN表達降低，而miR146a和miR155則干擾了Toll樣受體7和9下游的細胞內信號轉導通路，導致細胞亞群分化異常、B細胞活化以及自身抗體的產生[13]。

當脾臟和淋巴結中B細胞成熟成為抗體分泌細胞時，T細胞也會分化成為不同的效應細胞，如CD4+T輔助細胞(Th1、Th2、Th17)和細胞毒性CD8+T細胞。miRNAs參與這些細胞的分化成熟。目前的研究熱點集中在Th17細胞，該類細胞被認為參與了多發性硬化以及其他自身免疫性疾病的發生、發展[14，15]。小鼠缺乏miR155的T細胞不會誘導發生嚴重的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)，并且IL-17A顯著性地減低，而miRNA-30a則可通過降低IRF4的表達，抑制Th17分化[16]。miR155缺陷小鼠可以抵制膠原性關節炎的發生，并且通過STAT3信號通路損害Th17細胞的分化。更多的研究證實，miR155誘導Th17細胞分化的確是通過靶向作用于Jarid2基因[17]。不同于miR155是促進Th17的分化，miR210是限制Th17分泌IL-17，從而參與小鼠炎性腸病模型中的自身免疫性疾病發生機制。老年小鼠中miR210抑制了自身抗體的產生。過表達的miR210可以降低類別轉化重組以及調節缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)的表達，因此認為其可以限制T細胞和B細胞的自身免疫反應性應答[18]。

miR17～92簇也通過靶基因Pten和Ikzf4參與了Th17細胞分化和功能[19]。敲除miR17～92簇可抑制Th17細胞的分化，并減少EAE的發病。但是，miR17家族成員miR-20b可以通過靶基因Rorc和Stat3抑制Th17培養細胞分泌IL-17[20]。T細胞中過表達miR17～92可誘導抗雙鏈DNA自身抗體的產生、多個器官的炎癥、脾臟和淋巴結的腫大。這可能與miR17～92促進濾泡中Th細胞(Tfh)分化相關，部分是通過基因Pten和PKB磷酸酶Phlpp2靶向作用[21]。

三、miRNAs對Treg細胞的調控

miRNAs通過調控Treg細胞的穩態及功能在維持外周免疫耐受中發揮重要作用。FOXP3是Treg細胞的標志性分子，Foxp3基因突變能引起嚴重的自身免疫性疾病。小鼠FOXP3表達的細胞中Dicer或Drosha遺傳性消融會誘導致死性系統自身免疫性疾病。研究表明這些小鼠中Treg細胞在胸腺可以發育，但是具有miRNAs缺陷的Treg細胞維持穩態的能力明顯降低，不能充分發揮其抑制功能。

Treg細胞中miR155高表達呈FOXP3依賴的方式，miR155的缺失會損害Treg細胞的發育和動態平衡。缺失miR155的Treg細胞中其相應靶基因細胞因子信號1抑制因子(suppressor of cytokine signaling 1, Socs1)的表達升高，從而降低對IL-2的應答。IL-2是Treg細胞維持穩態的關鍵調節因子。但是，miR155并不是Treg細胞抑制功能所必須的，因為miR155缺失的Treg細胞也能預防小鼠的自身免疫性疾病[15]。

在體外，miR17～92簇聯合miR17和miR19作用限制Treg(iTreg)細胞分化。在體內，盡管miR17～92簇不是胸腺Treg細胞發育和維持穩態所必須的，但卻是自身免疫性腦脊髓炎中抗原特異性Treg細胞產生了IL-10的關鍵作用因子[22]。miR10a通常表達于Treg細胞，與小鼠自身免疫性疾病的易感性呈負相關[23]。高易感性的小鼠其miR10a的表達最低，而抵抗性的小鼠中miR10a的表達最高。miR10a穩定Treg細胞是通過靶向作用于轉錄抑制物Bcl6和Ncor2，從而促使Treg細胞產生持續高表達的Foxp3。因此，miR10a遺傳性消融并不能造成Treg缺陷或自身免疫。這也證實其他miRNAs如miR10b或者相關的miR99/100家族可能部分參與了Treg細胞功能調控。

盡管多個研究證實了特定的miRNAs參與了Treg細胞功能的調控，但是如何調控Treg細胞的信號通路仍然未知。其中PI3K通路受到多種miRNAs的調控，是CD4+T細胞分化成效應T細胞或Treg細胞的中心節點[24]。CD4+T細胞Dicer消融能增加哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的活性和對TCR刺激的敏感度。mTOR由PI3K通路活化，是抗原受體、細胞因子受體和TLRs的一個關鍵集成整合分子。小鼠PI3K信號增加導致效應CD4+T細胞增殖。實際上，增強PI3K信號可以阻斷Treg細胞中FOXP3的表達。PI3K信號提前終止會改變Treg細胞FOXP3的表達以及其相應的功能行為。這表明了PI3K信號的時間周期操控可以導致Treg細胞和效應T細胞之間平衡的改變。總之，這些通路的負性調節作用促進了Treg基因的表達程序，通過對PI3K通路、NF-κB和MAPK通路的研究會發現更多的miRNAs參與Treg細胞的發育和穩態功能作用的調控。

四、展 望

miRNAs作為一類在動植物及病毒中廣泛存在的單鏈非編碼小分子RNA，近年來已經成為表觀遺傳學領域研究的熱點。越來越多的研究表明miRNAs參與了自身免疫性疾病的發生和發展。盡管有很多的文章討論了不同自身免疫性疾病包括SLE、MS和EAE中多種miRNAs表達的改變以及對疾病發病機制的作用，但是本文著重于機體免疫耐受建立過程中miRNAs的調控作用，闡述了miR17～92、miR181、miR150、miR22、miR155、miR10a等對于T細胞、B細胞發育成熟以及相關功能的關鍵性調控作用。這些miRNAs表達的異常導致了自身免疫耐受機制的受損，致使自身反應性淋巴細胞的產生或功能活躍，最終促進自身免疫性疾病的發生和發展。總之，miRNAs是可行的的藥物靶點，深入認識miRNAs在自身免疫性疾病中的病理作用機制，設計序列特異性miRNAs抑制劑有望成為治療自身免疫性疾病的新型藥物。