通過編輯人類胚胎CCR5基因預防艾滋病事件的反思

盧光琇

2018年12月20日，國際著名期刊《科學》公布了2018年度國際上的十大科學突破及三大惡劣科學事件，其中南方科技大學的賀建奎副教授團隊應用CRISPR/Cas9技術進行以妊娠為目的的基因編輯事件被評選為影響最惡劣的三大科學事件之一[1]，作為2018年11月26日賀建奎在“第二屆人類基因編輯國際峰會”上宣稱其通過基因編輯出生的雙胞胎能天然抵抗艾滋病的“科研成果”的評判。實際上，賀建奎的基因編輯事件發生以來，已引起舉世關注和業界震驚。在中國，從包括衛健委和科技部在內的政府監管機構，到科學界以及大眾媒體，都對賀建奎副教授不負責任的臨床實踐表示強烈譴責。基因編輯到底是什么？為什么編輯人類胚胎CCR5(C-C chemokine receptor type 5)基因預防艾滋病會引起如此大的擔憂？通過此事件我們需要總結什么經驗教訓？帶著這些問題，本文試圖反思CRISPR/Cas9技術對人類胚胎進行CCR5基因編輯的事件，總結相應教訓，規范科研行為。

1 國際上的研究顯示基因編輯安全性和有效性沒有得到充分證明

基因編輯，就是對生物體自身的基因進行有目的、精確的改造，包括插入新基因、敲除原有的自身基因和 “矯正”生物體有缺陷的基因等[2]。基因編輯的發展可以追溯到50多年前人類對于遺傳病基因治療的探索。1963年，諾貝爾獎獲得者喬舒亞·萊德伯格(Joshua Lederberg)第一次提出了基因交換和基因優化的概念，設想通過引入外源DNA進行基因修飾以有效治療人類遺傳疾病。1968年，美國醫生羅杰斯(Stanfield Rogers)證明病毒可以作為載體攜帶基因，1970年，他應用含有精氨酸酶的乳頭瘤病毒載體來治療一對姐妹的精氨酸血癥，但試驗以失敗告終。1980年，美國克萊因教授應用DNA重組技術將β-珠蛋白基因導入一個患地中海貧血的重癥患者的骨髓細胞中，然后回輸到體內，但試驗還是以失敗告終。同時，由于該項目沒有通過倫理審查，違反美國聯邦法規，克萊因本人因此受到了包括被剝奪了系主任以及基金申請資格在內的嚴厲懲罰。

20 世紀七八十年代，基因治療的基礎研究進展較快，發現了限制性內切酶、DNA 連接酶和逆轉錄酶等與基因治療密切相關的關鍵酶，基因重組工程技術得到了前所未有的發展；90年代初，臨床前疾病模型的成功建立，標志著基因治療技術體系的初步建立，由此啟動了病毒載體基因治療的臨床試驗。

1990年美國安德森(William French Anderson)醫生團隊成功地實施了歷史上首例基因療法的臨床試驗。他們在體外利用逆轉錄病毒載體基因轉移技術對從一個由于腺苷酸脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)缺陷導致重癥聯合免疫缺陷病4歲女孩體內分離的白細胞進行ADA基因治療，該女孩癥狀得到緩解，由此燃起了人們對于基因治療的期望。從1990年～2000年，全世界有4 000多名患者參與了500個基因治療臨床項目。但1999年，美國賓夕法尼亞大學對一位患有鳥氨酸氨甲酰基轉移酶缺乏癥的18歲美國男孩Jesse Gelsinger實施腺病毒載體注射的基因治療研究時，該男孩在接受注射4天后因免疫反應帶來的細胞因子風暴導致多器官衰竭死亡。此事件再次引起了人們對基因治療的安全性的擔憂，也促使基因治療的研究從亢奮回歸理性。之后，科學家們繼續開展一些零星的研究。2000年，法國阿蘭·費希爾(Alain Fisher)領導的研究組在2002年～2003年，對重癥聯合免疫缺陷綜合征患者實施ADA基因治療中，有2例出現了類白血病樣癥狀。其原因可能與采用的鼠白血病病毒載體的整合位點有關，導致某些細胞的失控性生長。這一事件導致基因治療臨床試驗受到了更嚴格的監管，安全示范標準比其他治療方法設置的都要高出很多。

傳統的基因治療只是通過病毒載體導入基因，并不是精準的定點整合基因修復，是隨機整合。近年來，科學家們經過研究，發現在核酸酶的誘導下能有效地切割靶序列形成雙鏈斷裂，通過非同源末端連接(non-homologous end joining,NHEJ)實現特定片段或堿基的缺失或插入，或者在同源模板DNA的存在下，通過同源重組修復(homology directed repair,HDR)機制實現精確的基因修復[3]。目前已發展了三大基因編輯技術，包括鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease,ZFN)、轉錄激活樣效應因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)和常間回文重復序列叢集(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)。ZFN基因編輯技術又稱第一代基因編輯技術，但ZFN技術需要為每個靶基因定制與其結合的效應蛋白，因此限制了ZFN的廣泛應用[4]。TALEN又稱第二代基因編輯技術，可以切割任何感興趣的DNA序列，但是TALEN方法仍然需要為每段DNA序列設計一對特定的核酸酶[5]。2012年，Doudna和Charpentier發現了細菌防御系統中的常間回文重復序列叢集/常間回文重復序列叢集相關蛋白9系統(CRISPR/Cas9)，并發展成第三代基因編輯技術，該技術可以通過一段特殊的引導RNA(gRNA)對感興趣的DNA位點進行有效編輯[6]。CRISPR/Cas9技術因具有操作簡單、成本低以及編輯效率高等優點，被《科學》雜志列為2013年度十大科技進展之一。

盡管目前已發展到第三代基因編輯技術，但基因編輯的安全性和有效性仍未得到充分的證明。目前發表了大量應用CRISPR技術編輯人類廢棄胚胎的文章，包括2017年在國際頂級期刊發表的文章[7-8]，我國學者也在這一領域進行了一系列開創性的研究，包括2018年我國科學家成功利用堿基編輯修復了人類胚胎中的馬凡綜合征(Marfan syndrome,MFS)致病性基因突變[9]。基于前期基因治療過程中發生的一系列安全事故，人們對于基因編輯更加謹慎。總體而言，目前的共識是基因編輯只能用于研究的目的，不能用于單純生殖目的。

2 我國的探索也顯示目前胚胎水平的基因修飾仍存在安全性問題

我國學者盧惠霖在20世紀70年代就提出了積極性優生的設想，即可以在配子和胚胎進行遺傳學改造，避免遺傳缺陷患兒的出生，實現積極性優生。按照這個設想，人們早期試圖通過轉基因手段來實現遺傳病的治療。以顯微注射的方法，先后構建EB病毒、EB病毒潛伏膜蛋白基因、人類淀粉樣前體蛋白基因瑞典型突變等轉基因小鼠，發現顯微注射方法制備的轉基因小鼠，基因隨機整合，存在位置效應,可能插入到其他染色體，破壞重要的基因并可能導致新的疾病，因此，轉基因不是基因治療的理想方法。接下來，人們試圖建立基于小鼠同源重組的基因治療技術，即基因打靶策略。在建立小鼠基因打靶技術平臺時，國際上出現了人類胚胎干細胞(human embryonic stem cell,hES)技術。人們想到人類胚胎干細胞建系與建庫是另一種治療遺傳病的可行思路：將來一些遺傳病患者，有可能通過人ES細胞誘導成所需要的細胞與器官來治愈遺傳缺陷，就像汽車零件壞了可以配一個零件進行修理，將來也可以通過干細胞誘導分化為人體“新零件”來進行修復。筆者2001年首次建成了國內的第一株人ES細胞系，2004年被批準成立人類干細胞國家工程研究中心，2009年在CellStemCell雜志上報道構建了世界上最大的ES細胞庫，建立了174株人ES細胞，即可以滿足湖南省6 700萬人口進行細胞與器官移植的組織配型需求[10]。

現有研究證實了基因編輯的有效性。2014年，Zhou等[11]通過ZFN基因編輯技術，在體外敲除p53基因同時過表達NeuroD2基因，成功將人的成纖維細胞“誘導”為功能性神經元，實現了從一種終末細胞向另一種終末細胞的轉分化，有望為脊髓損傷、帕金森病、阿爾茨海默病的神經細胞替代治療提供新的細胞來源，同時避免免疫排斥的問題。

但基因編輯如果應用于人類的基因治療，其安全性如何？還需要大量的基礎研究。因此，目前人們從預防入手，應用產前診斷和胚胎植入前遺傳學診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)避免遺傳性出生缺陷患兒出生。1990年，筆者建立了國內最早的植入前遺傳學診斷鼠胚模型，1998年應用于人類，2003年對染色體羅氏易位攜帶者實施PGD，出生了健康的子代。2017年8月，國際著名期刊Nature以China's push for better babies為題，肯定了包括筆者醫院在內的中國生殖醫學界通過PGD預防遺傳性出生缺陷的工作[12]。迄今為止，筆者已完成11 588個PGD周期，出生了3 023個健康孩子，還有1 000多個孩子正在妊娠中。

3 基因編輯胚胎CCR5基因對于預防艾滋病目前技術上不成熟

艾滋病是由于HIV病毒感染引起的，包括HIV-1與HIV-2兩種亞型，艾滋病以HIV-1感染為主。編輯CCR5基因來預防艾滋病來自于20多年前的發現。1996年科學家發現，10%歐洲人群中存在CCR5-Δ32基因變異,這種變異表現為CCR5基因的32個堿基缺失導致的蛋白質翻譯提前終止，并且攜帶這種變異的人群可以顯著抵抗HIV-1感染。

CCR5是一種G蛋白偶聯受體，與多種下游信號蛋白相互作用，在免疫系統中作為趨化因子受體而發揮作用。HIV-1感染人類時，需要通過CD4分子及其輔助受體趨化因子受體CCR5或CXCR4發生相互作用 (CXCR4也是HIV感染CD4+T細胞的幾種趨化因子受體之一)[13]。因此，當CCR5基因失去功能時，CCR5受體的功能被阻斷，HIV-1病毒不能感染人的CD4細胞。因此，編輯CCR5基因，使在理論上治療與預防艾滋病成為可能。

2014年,Tebas團隊[14]發表在《新英格蘭醫學雜志》上的報道稱，他們從12名艾滋病病毒感染者體內提取未被感染的 T 細胞，并對該細胞的 CCR5 基因進行改造，將編輯后的細胞回輸到艾滋病患者體內后顯著提高了機體對艾滋病病毒的抵抗能力。2015年中國深圳啟動了基因編輯治療艾滋病的“863計劃”課題，用CRISPR/Cas9技術對艾滋病患者造血干細胞或T細胞的基因組進行編輯，將敲除CCR5基因的T細胞再回輸到艾滋病患者身上，以此切斷HIV病毒進入細胞的通道。2016年，廣州醫科大學研究團隊報道使用CRISPR/Cas9技術對人類異常受精卵CCR5基因進行編輯，并獲得了能有效免疫艾滋病毒的CCR5-Δ32突變的胚胎[15]。2017年我國科學家通過CRISPR技術對人HSPC細胞的CCR5基因進行編輯，移植到小鼠體內后能產生正常的免疫細胞，進而阻止HIV的擴散，這是首次利用CRISPR技術在動物模型中成功地讓HSPC細胞發生持久的CCR5突變[16]。

但以往編輯CCR5基因用于預防和治療艾滋病，是在體細胞水平，是針對艾滋病患者本身進行的基因治療，這不導致患者本身基因組的改變，在安全性已經經過了大量的基礎研究，是傳統基因治療的一種方式，在倫理上也比較容易接受。而在胚胎水平對基因進行編輯，目前在技術上還是不行的，主要表現在基因編輯的安全性問題沒有得到很好地解決，涉及在以下四個方面。

第一，艾滋病病毒進入人體的方式是多種多樣的，CCR5只是其中一個非常重要的受體，但病毒仍然可以繞過它并通過其他機制進入細胞。所以，即使完全敲除CCR5基因，也不能徹底阻斷艾滋病病毒進入細胞。

我們知道，在全社會固定資產投資中，按資金來源劃分為預算內資金、金融機構貸款、外商投資和自籌投資、其他投資五個部分，前三個部分都有明確的界定和相對制度化的融資機制，而自籌投資和其他投資則十分復雜。因此，要準確對一個國家(或地區)的社會游資總量進行測算是非常困難的。浙江省到底有多少社會游資，這是一個大家比較關注的話題。目前，關于游資的度量，理論文獻尚未提出合理的測算方法。二戰后，經濟學界曾試圖對地下經濟的規模做出估量，并提出了一些估算方法，如固定比率法、加特曼法、現金比率法等。我國學者運用這些方法對國內的社會游資總量進行了測算。

第二，HIV-1有多種亞型，不同的亞型感染細胞時可能涉及到不同的輔助受體(CCR5或CXCR4)，而中國人主要流行的是CRF01_AE亞型[17-18]，其感染途徑主要通過CXCR4受體(X4艾滋病毒株侵入受體)，而歐洲主要為B亞型，其感染途徑主要通過CCR5受體(R5艾滋病毒株侵入受體)，因此，敲除CCR5基因應用到中國人群理論上也只能避免部分人感染艾滋病病毒。

第三，CCR5基因是經過長期進化，在各種物種中高度保守的基因，在骨髓、淋巴組織和腦等多種組織中有表達，這提示CCR5對于維持正常生理功能有重要意義。CCR5可以結合β-趨化因子以保護神經元，所以對CCR5進行基因編輯可能會使得一些相關功能丟失。CCR5基因在幾種腦炎病毒(如西尼羅病毒、鼠肝炎病毒和單純性皰疹病毒)感染招募T細胞時起重要作用，因此基因編輯過的嬰兒可能會面臨一系列可能的感染[19]。敲除CCR5基因固然降低了人們感染艾滋病病毒的風險，但同時增加了感染其他病毒的風險。

第四，CRISPR/Cas9基因編輯技術的脫靶問題還沒有完全解決。所謂脫靶，就是基因編輯這把手術刀沒有精確地按設計進行手術，敲除CCR5可能會影響到其他基因，進而影響到細胞功能。筆者也曾以胚胎干細胞為材料，應用CRISPR/Cas9技術研究基因編輯CCR5基因的安全性，研究結果顯示目前還不能確保其安全性。筆者利用10枚經過CCR5基因編輯后發育至囊胚階段的胚胎分離胚胎干細胞系，共獲得2株胚胎干細胞，編輯后進行基因測序，結果提示其中1株胚胎干細胞系可能存在嵌合，并發現有可疑的脫靶位點，因此，在完全排除基因編輯的脫靶問題的情況下，將基因編輯技術應用于臨床為時過早。

4 基因編輯仍前景廣闊，不應因噎廢食

賀建奎宣布成功“培育”出基因編輯嬰兒受到廣泛質疑與猛烈批評，同時也引發了科學界對于基因編輯的發展會因此受到阻滯的擔憂[20-21]。哈佛醫學院科學家喬治·戴利(George Daley)表示，不希望因此次事件讓人們放棄對CRISPR技術的興趣，更不希望基因編輯技術未來的發展受到影響。

任何醫療新技術的出現及應用，都不是一帆風順的，要經歷螺旋式前進、遇挫甚至是倒退和再前進的過程，最終才能以更穩健的面目走上歷史舞臺。早期的基因治療技術，其發展經歷了多次的艱難。從充滿希望到一度被禁止，再到目前因為基因編輯技術的出現而對人類一些遺傳疾病的預防給予“綠燈”放行，經歷了慢長的過程。目前有多種嚴重致畸、致殘、致死的遺傳病，例如，臺-薩氏綜合征(Tay-Sachs diesease)或囊腫性纖維化等遺傳疾病，已經被包括美國食品藥品監督管理局在內的機構批準實施基因治療。但目前人們對于基因編輯的臨床應用主要還是限于體細胞基因編輯以治療遺傳缺陷或者腫瘤等重大疾病。

科學經常會引起倫理的爭議，但在法律規定和倫理規范的監管下會得到更好的發展。2015年4月，我國中山大學的黃軍就科研團隊利用CRISPR/Cas9技術，修改人類胚胎中可能導致β型地中海貧血的基因[22]，并將成果發表于正式的學術雜志《蛋白質與細胞》上，起初遭到國際生物醫學界的反對，《自然》和《科學》雜志認為其研究可能引發難以預料的風險，強調應對人類胚胎研究加以嚴格限制，以避免其應用導致不安全和不合倫理的后果。但由于他所進行的研究選用的是三原核受精卵胚胎，這是輔助生殖技術臨床應用中不能用于移植的廢棄胚胎，并沒有違反國家的法律與法規。不久他的研究價值得到肯定，并在年底轉而被《自然》雜志評為年度人物。黃軍就的研究引發的沖突促成了相關國際倫理制約機制的建設。2015年12月，中英美等國共同成立了“人類基因編輯：科學、醫學和倫理委員會”，并在其后起草的報告《人類基因編輯：科學、倫理學和治理》中原則上承認了胚胎基因編輯在倫理上的可接受性。而今年7月英國納菲爾德生命倫理學理事會所發布的報告進一步指出，在充分考慮科學技術及其社會影響的條件下，通過基因編輯技術修改人類胚胎、精子或卵細胞細胞核中的DNA在“倫理上可接受”。

5 我們應吸取的教訓

賀建奎事件為什么引起人們的震驚，并被廣泛的譴責，在于他不但不能從技術上確保方案的安全性與有效性，突破了國際上對于基因編輯倫理的紅線，而且同時突破了中國的倫理與法律底線。我國頒布了《人類輔助生殖技術管理辦法》，其中的輔助生殖技術倫理原則對于胚胎研究及基因編輯有明確規定，包括：醫務人員不得進行各種違反倫理、道德原則的配子和胚胎實驗研究及臨床工作。可以以研究為目的，對人體胚胎實施基因編輯和修飾，但體外培養期限自受精或者核移植開始不得超過14天。在胚胎水平進行基因編輯，只限于研究目的，應用廢棄胚胎。而基于生殖目的，應用基因編輯技術出生孩子，是中國的法律與倫理絕對禁止的。筆者認為基因編輯對于遺傳病的研究還是很有價值的，但徹底的基因編輯方式還是應該從精子、卵子或者單細胞受精卵來進行，同時需要在臨床前進行大量的動物實驗和臨床前試驗，通過國家級的批準以及技術各方面安全性、有效性等的評估，才能用于生殖細胞。

如何確保生命科學領域的新技術，真正安全有效地服務于人類，是擺在包括科學家與政府在內全人類的共同問題。新技術需要在科學上確保安全性與有效性，在法律上遵守國家法律的底線，同時受到倫理的約束與監管。建議我國，對于重大的科學技術的臨床應用，不能以市級、省級甚至是某一個醫院的批準來執行，而應該在國家層面上進行包括科學界、法律界、倫理界、患者、群眾代表等成員參與的廣泛聽證，新技術應用的申請者可以充分闡述其申請的理由，參與聽證的成員需在各個層面深入探討新技術應用的利與弊，以國家認可的方式實施，并接受國家層面的嚴格監管。這樣，既不會因某個事件導致科學技術的停滯，打壓科學創新，又能使新技術在符合倫理與法律的框架實施，不會導致新技術被某些醫療機構濫用，或者被某些科學“狂人”利用。