云南春燥證動物模型建立過程中的問題及思考

魏寧頤,何 丹,林 麗,王雪梅,林銀驥,楊 梅

(云南中醫學院,云南 昆明650500)

1 實驗動物

現國內外可以作為實驗用的動物有百余種,大致可以分為三類：哺乳類、鳥類、兩棲類。鳥類動物在實驗中因場地及個體生存因素要求較多,未被采用。兩棲類如青蛙多用于實驗教學,本課題也暫不考慮。另外,考慮實驗動物當與人體生理、病理相似,故課題組擬從哺乳類中選擇實驗動物。哺乳類實驗動物常用的有：兔、猴、狗、大鼠、小鼠等。家兔對溫度變化表現明顯；犬貓科動物對喂養食物敏感,容易發生嘔吐反應；猴進化程度與人類最為相似,為理想的實驗動物,但其飼養成本高,課題組經費有限最終也未選擇。大鼠多用于安全性試驗及生長發育相關的研究,對呼吸道疾病有較強的抵抗力,為更好地觀察云南春燥證引起的呼吸道病理改變,也未選用。小鼠形體小、飼養空間成本要求低,且對溫差敏感,2～3℃就能引起生理上的改變,符合中醫動物模型必須充分體現中醫的基本特點并結合辨證論治等思路[4-5],且有文獻表示小鼠可以用于解熱鎮靜研究[6]。現我國實驗小鼠種類繁多,經過科研工作者的多年選育,昆明種小鼠適應力強,成活率高,飼養成本低,我國有70%的中醫證候實驗采用昆明種小鼠,具有豐富的實驗基礎。最終課題組結合實驗需要及相關實驗指標的要求選取昆明種小鼠作為實驗用鼠。

2 制模因素

中醫證候動物模型的制作方法有模擬病因、復制癥狀、藥物反證等方法,本研究采用模擬病因的方法來制作云南春燥證動物模型。

中醫學用陰陽來概括自然界和人體,陰在內,陽在外,陰陽失調可以為致病因素。云南春燥證形成的原因也可以從內外2個因素考慮。在外為云南地區春季特有的氣候因素：多風、少雨、土質稀薄不易存水、1000多米的海拔紫外線強度較高；在內為云南人嗜食辛辣的飲食特征。考慮以上2種重要原因,造模選擇在特殊制定的人工氣候箱進行,課題組借鑒西北燥證造模經驗,及外燥證小鼠造模經驗,在了解云南地區春季平均氣溫后,最終將云南春燥模型造模外因因素定為溫度(23±2)℃,相對濕度(31.5±2)%,每日am10∶00-pm8∶00打開風扇,風速2.7m/s進行吹風,同時給予正常光照。課題組自配小鼠可用的香燥飼料配方如下,辣椒粉∶五香粉=1∶3,飼料∶香燥配料=100∶1(五香粉為云南昆明華瑞食品加工有限公司生產),從而模擬云南春燥的致病內因。

3 實驗指標

云南春燥證臨床常以口鼻、咽喉、肌膚干燥和干咳為臨床特征[3]。故實驗在初步設計指標時擬選取三個基本指標,意在驗證造模方法的可行性及效果。小鼠生物表征(活動度、飲食、二便、毛發),腹背皮膚含水率,氣道sIg A、SP-A以及SP-D,小鼠腹部、背部肌膚的含水率,以測量春燥環境對小鼠皮膚干燥程度的影響。

實驗過程中課題組對小鼠生物表征進了觀察,目前得到一些表征的變化[7-8],例如實驗小鼠出現煩躁、易怒、可見實驗小鼠身上打斗后的咬痕；小鼠毛發稀疏,缺少光澤；爪甲顏色變暗等。欲提高實驗準確度,建議實驗后期對這些生物指標進行定量分析,制定定性分析表,采用更多的實驗手法驗證小鼠生物表征、生活習性等,而非只是目前的定性分析,讓實驗更具定量意義。實驗初期,因動物頸部猝死后摘取肺組織進行病理檢測,故腹部皮膚采樣面積過小,無法進行含水率的測量,建議后期實驗中注意再殺小鼠方式,盡量保證小鼠腹部皮膚完整性,以便于進一步測量腹部皮膚含水率。

4 模型標準

課題組造模采取的是病因造模法,在判斷模型是否成功因素上,參考云南春燥證臨床癥狀,效仿丁建中[9]、楊靜寧等人[10]應用桑杏湯、沙參麥冬湯分別檢測溫燥及陰虛內燥的方法,驗證云南春燥動物模型。初步篩選部分指標進行論證,例如：小鼠皮膚含水率降低、小鼠二便干燥、小鼠呼吸道出現因干燥引起的一系列病理性反應,如氣道免疫球蛋白、呼吸道組織變化、大腸組織變化、呼吸道纖毛運動等。同時對造模小鼠給予桑杏湯治療,實驗結果表明,桑杏湯組小鼠情志、體重、飲食量、飲水、毛發、二便等均有改善,氣道sIg A、SP-A以及SP-D含量均明顯下降。結果提示桑杏湯干預下的云南春燥證小鼠模型臨床癥狀有所改善,可以說明云南春燥受外燥影響明顯[11]。

5 存在的問題

當前階段課題組依據文獻及相關類似實驗經驗采用病因造模法,探討穩定并可以復制的云南春燥證造模方法。在造模2周后檢測了部分實驗指標,包括生物表征、皮膚含水量、氣道免疫球蛋白等,實驗結果所示[6-7]小鼠經過2周的人工氣候箱飼養,已經開始出現生物表征的變化,這種變化隨著飼養在干燥氣候的時間增加而越來越明顯；小鼠的肺組織及氣道內sIg A、Sp-A含量下降,SP-D、IgG含量上升。因實驗處在起步階段,當前實驗指標過少,無法準確判斷造模是否成功。課題組應當進一步擴大實驗指標檢測范圍,篩選云南春燥證黃金指標,例如代表肺津的水通道蛋白、免疫應答白介素細胞、呼吸道黏膜運動情況等指標。同時,在現階段已出現變化的實驗指標上,進一步采取以方測證法、反證動物模型,進一步完善云南春燥動物模型的科學性。

6 結語

本課題組云南春燥證動物模型的研制已開展一段時間,目前課題組已初步完成模型的建立,并檢驗了小鼠生物表征(活動度、飲食、二便、毛發),背皮膚含水率,氣道sIg A、SP-A以及SP-D這些指標,從目前實驗數據來看,云南春燥動物模型的建立已取得階段性成果。但為確保實驗的嚴謹性、科學性,建議課題后期重點篩選更多實驗指標,規范實驗客觀指標,盡可能應用可量化實驗指標。同時進一步確定云南春燥證動物模型的黃金指標,并對已出現變化的實驗指標進行“以方測證”,運用反證方法對動物模型進行檢測,建立科學的可復制的云南春燥動物模型。