外泌體在阿爾茨海默病發病機制和診療中的作用

張 銳，王永祥，杜怡峰※

(1.聊城市人民醫院神經內科，山東 聊城 252000； 2.山東大學附屬省立醫院神經內科，濟南 250021)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種與人類年齡有關的進行性退行性疾病，其典型臨床特征主要包括意識障礙、認知功能障礙、記憶力下降、生活能力下降直至活動能力喪失。截至目前，全球有3 000余萬AD患者，且大多數患者是散發的，只有5%的患者早期發病與遺傳因素有關[1]。世界衛生組織預計，到2050年AD患者將達1.15億人。曾新穎等[2]在1990—2016年中國及省級行政區疾病負擔報告中指出：2005—2016年我國AD增幅為57.8%。因為AD病因復雜，起病隱匿，往往不能被及時發現，同時針對AD治療的藥物研究均以失敗告終。2019年初，Biogen和Eisai兩家制藥公司又宣布停止AD藥物研究的ENGAGE和EMERGE Ⅲ期臨床試驗。所以目前缺乏治療AD的積極有效措施，這不僅增加了社會和家庭的壓力，也使其成為不可忽視的重大疾病。外泌體是1983年科學家在研究網織紅細胞時發現的，其最初被認為是細胞處理不需要物質的一種細胞機制[3]，到1987年外泌體才有了比較明確的定義。研究證實，特殊分泌囊泡——外泌體不但可以參加組織與細胞之間的通信，而且能廣泛參與生理進程和病理的傳播，因此備受重視[4]。現就外泌體在AD發病機制和診療中的作用予以綜述。

1 外泌體概述及其生物學特性

外泌體實質上屬于一種胞外囊泡，其直徑為40～200 nm，由核內體通過逆行出芽的方式內陷形成，隨之出現多囊泡體，多囊泡體內含有大量腔內囊泡。多囊泡體不僅可以和胞膜融合將其中的腔內囊泡釋放到細胞外環境，還能結合溶酶體來降解其內容物，或繼續留在細胞內，形成Weibel- Palade小體、黑色素小體等特殊的細胞器。內源性蛋白質被分揀進入腔內囊泡的機制有兩種，即內涵體分選復合物依賴型和非依賴型。其中，細胞因子(內涵體分選復合物)的組件腫瘤易感基因101和ALG- 2相互作用蛋白X、鞘脂神經酰胺在蛋白質的分選過程中均起控制作用。此外，在缺乏內涵體分選復合物時也有生成腔內囊泡的情況，所以推斷目前還有不清楚的產生腔內囊泡方式存在[5]。

外泌體存在于各種體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液、母乳等，并攜帶有不同的脂質、蛋白質、DNA、微RNAs(microRNAs，miRNAs)、信使RNA、長鏈非編碼RNA及某些病毒來源的遺傳物質[6]。在人體多種病理生理條件下的外泌體亞群均已確定[7- 8]，其攜帶的獨特生物學內容物可以代表原始細胞源的生理和病理狀態。在神經系統里，神經干細胞、少突膠質細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞和神經元均能分泌外泌體，且在腦脊液中已發現上述來源的外泌體[9]。

外泌體作為神經細胞通信的信使，不僅能在一定程度上支持神經細胞，還能為神經細胞生理功能穩定提供保障，同時對中樞神經系統平衡發揮調節作用[10]。其作用方式包括直接作用于受體細胞；將特異性傳染顆粒或功能性蛋白質傳遞給受體細胞；直接在細胞間進行受體轉移等。在生理機制下，間充質細胞來源的外泌體有利于軸突的發育，星形膠質細胞來源的外泌體可以選擇性分泌神經保護物質，促進細胞存活。在病理作用下，一些外泌體又可能具有傳播或清除毒性物質的作用，如AD中的β淀粉樣蛋白(β- amyloid protein，Aβ)和Tau蛋白，以及亨廷頓病中的多聚谷氨酰胺蛋白和大量重復的RNA，在神經退行性疾病中，蛋白質突變導致錯誤分選或錯誤折疊，同時Aβ和Tau蛋白降解途徑受阻，造成外泌體攜帶錯誤折疊或突變后的有毒蛋白質擴散，推動退行性神經疾病的形成并不斷演化[11]。

2 外泌體參與AD的發病機制

外泌體在AD病理過程中的作用包括參與Aβ的代謝、傳播、聚集、清除以及對Tau蛋白的傳播和轉運，這早在2006年就已被Rajendran等[12]證實。除了Aβ外，神經退行性疾病也會受磷酸化Tau蛋白的影響。作為腦微管相關蛋白，Tau蛋白能直接結合微管并調節其結構和功能[13]。Tau蛋白在磷酸化過度條件下會將神經原纖維纏結觸發，并參與神經退行性疾病的擴散。Asai等[14]對兩種Tau蛋白小鼠模型(AAV- Tau蛋白注射模型和轉基因PS19模型)進行研究發現，減少小膠質細胞可以抑制Tau蛋白的傳播，且抑制外泌體的合成也可以減少Tau蛋白的傳播，可見小膠質細胞來源的外泌體是在神經細胞中傳播Tau蛋白的重要工具。此外，與外泌體相關的磷酸化Tau蛋白也可分別從AD患者血液和腦脊液中分離出來[15]。Polanco等[16]實驗表明，從小鼠腦細胞外間隙分離的外泌體樣囊泡中的Tau蛋白所占比例較高，且其已出現一定程度的磷酸化。這表明，外泌體參與了Tau蛋白的運輸和傳播。因此，外泌體與淀粉樣物質和Tau蛋白傳播有關是造成AD細胞毒性和神經病變蔓延的機制之一[17]。且其他神經退行性疾病(帕金森病)的研究也得出類似結論[18]。Sarkar等[19]在AD實驗小鼠和AD患者的相關腦區內均發現miR- 34a高表達，鄰近神經元細胞攝取高表達miR- 34a的外泌體后，整合素- 金屬蛋白酶10、沉默信息調節因子2相關酶1基因被miR- 34a靶向阻斷，Aβ出現并沉積。

也有研究認為，外泌體在Aβ的病理和功能影響中也有有益作用。An等[20]和Falker等[21]的研究顯示，小鼠神經母細胞瘤細胞分泌的外泌體可以消除AD患者腦中Aβ斑塊對突觸可塑性的破壞。Yuyama等[22]認為，細胞外的外泌體(神經元分泌)對Aβ構象產生誘導作用，使Aβ向淀粉樣纖維(無毒)轉變，且對小膠質細胞攝取Aβ有促進作用，細胞內的Aβ則被外泌體運輸到溶酶體進行降解。在后續研究中，他們將外泌體注入AD轉基因小鼠的腦部發現，注入的外泌體可以誘導Aβ被小膠質細胞吞噬[23]。此外，在APP/PS1大鼠模型認知功能改善的實驗中，經過缺氧處理的間充質干細胞分泌的外泌體中的促炎因子(腫瘤壞死因子- α、白細胞介素- 1)水平下降，但抗炎因子(白細胞介素- 4、白細胞介素- 10)水平升高，說明外泌體可通過抑制炎癥反應來減緩AD發展[24]。

可見，外泌體在AD中可能具有“雙面性”，既可促進淀粉樣物質、Tau蛋白等毒性物質的傳播，也可減輕病理性損傷。因此，由各種細胞分泌的功能不一的外泌體可能對機體的代謝平衡起維持和調節作用，這種動態平衡的失衡導致病理狀態的出現。

3 外泌體在AD診斷中的價值

作為神經性退行性進展疾病之一，臨床已采用影像學和神經心理學測試來輔助診斷AD，但大多數AD患者前階段可能是無癥狀的，且這個階段最長可達17年[25]。目前，腦脊液內的Tau蛋白、Aβ是臨床診斷AD的主要標志物，由于在AD患者腦脊液/血漿中提取的外泌體中發現了與疾病相關的蛋白，所以外泌體在臨床已被作為AD的生物標志物之一。Fiandaca等[15]通過對血漿中神經細胞來源的外泌體進行研究發現，外泌體中的p- T181- tau、p- S396- tau和Aβ1～42在臨床發病前數年即可對AD做出預測。此外，可以通過檢測外泌體中Aβ的表達水平監測AD的發病情況。

Goetzl等[26]對28名正常人、16例額顳葉癡呆患者和12例AD患者進行分析發現，只有AD患者的突觸素1和生長相關蛋白43水平下降。這證實，對于AD可能可將神經細胞外泌體突觸蛋白作為其臨床預測指標。

Vesiclepedia數據庫列出了在33種外泌體中發現的兩萬多種信使RNAs和近五千種 miRNAs，包括病毒RNA、轉運RNA片段、小核RNA、核仁小RNA、Piwi互作RNA、非編碼RNAs等[27]，這些被稱為外泌體源性RNAs可成為AD診斷的新標志物。

外周血中外泌體攜帶的miRNAs因充分保有源神經細胞分泌時的內容物而逐漸成為新的AD生物診斷標志物[28]。Lugli等[29]采集了35例AD患者的血清提取其外泌體中的miRNAs，并篩選出20個表現有顯著差異的miRNAs，其中miR- 342- 3p被認為是獨立診斷AD的生物標志物。另一項試驗將AD 患者、輕度認知障礙患者與健康對照者血清中的外泌體進行比較發現，14種miRNAs表達上調，3種miRNAs(miR- 1306- 5p、 miR- 342- 3p、miR- 15b- 3p)表達下調[30]。Yang等[31]在107例AD患者與正常對照者的對照試驗中發現，血清外泌體中的miR- 135a和miR- 384表達上調，但miR- 193b的表達下調。Riancho等[32]報道，AD患者腦脊液外泌體源性RNAs表達譜中15個miRNAs發生明顯變化，其中正常對照者50%與70%的樣品中分別檢測出miR- 9- 5p與miR- 598，而所有AD患者樣品中均未檢測到，提示miR- 9- 5p與 miR- 598可能是AD潛在的標記分子。可見，miRNAs作為診斷生物標志物具有廣闊的發展空間。

腦脊液、血液、尿液、血漿、血清中均可以提取出miRNAs，其提取可通過實時熒光定量聚合酶鏈反應、基因芯片、深度測序技術完成，而作為AD標志物循環中的miRNAs可通過新一代高通量測序技術識別。

4 外泌體與AD的治療

研究表明，細胞外囊泡的關鍵特征是它們可以在中樞神經系統和外周循環之間傳播，其既可被當成清除有毒蛋白質的平臺，也可以繞開血腦屏障，故使得改良的細胞外囊泡可成為獨特的藥物輸送方式[33]。外泌體具有的基本特征包括：①外泌體本身屬于一種膜性囊泡(來自于細胞分泌)，這使得它們具有生物運輸載體的特性[34]；②外泌體能在相鄰細胞或器官之間運輸特有的內容物；③外泌體可以有效地穿透血管屏障[35]。且外泌體作為治療方式也是安全可控的：①外泌體不能夠自我復制，不會像瘤細胞樣轉移；②外泌體是一種脂質囊泡，其可以運載人工合成的內容物，在生物工程中可以進行質量和劑量控制；③治療用的外泌體可以取自患者自身，從而避免了潛在的免疫并發癥。這些特性使得外泌體可成為一種治療神經系統疾病的新方式、新載體。

神經元漸進性丟失，神經原纖維纏結，Aβ沉積過度，這是AD具有的典型特征。腦啡肽酶能降解Aβ的沉積，有試驗利用間充質干細胞分泌含有腦啡肽酶的外泌體，通過核外遞送的方式運輸至大腦發現，其可以減少Aβ積累，減輕AD的癥狀[36]。將這種方式運用于靶向治療，已在小鼠模型中進行了實驗。Katsuda等[36]試驗發現, 脂肪干細胞來源的外泌體中存在腎胰島素殘基溶酶的高表達, 而這種酶可有效降低大腦中Aβ的水平，進而減少Aβ積累。

β- 淀粉樣前體蛋白裂解酶1隸屬于蛋白酶家族，其可有效裂解淀粉樣前體蛋白N端，從而造成Aβ積累。Alvarez- Erviti等[37]利用電穿孔法將載有干擾小RNA的樹突狀細胞來源的外泌體通過血腦屏障輸送至大腦，結果造成信使RNA和β- 淀粉樣前體蛋白裂解酶1呈劑量依賴性顯著下調，從而減少Aβ積累，緩解了AD的病理進程。

Wang等[38]發現，短發夾RNA介導的前列腺凋亡反應蛋白- 4下調可以使凋亡減輕，前列腺凋亡反應蛋白- 4是一個對鞘脂神經酰胺敏感的蛋白。淀粉樣肽可以誘導富含前列腺凋亡反應蛋白- 4/C18神經酰胺的外泌體分泌，但在缺乏中性鞘磷脂酶2的星形膠質細胞中沒有觀察到凋亡，說明由中性鞘磷脂酶2產生的神經酰胺對于細胞凋亡很重要，故認為中性鞘磷脂酶2是AD的潛在藥物治療靶點。后續試驗也證明，通過藥物抑制中性鞘磷脂酶2，AD患者淀粉樣斑塊在腦部的沉積量下降[38]。此外，通過增加5XFAD小鼠血清中的神經酰胺抗體，可以減少Aβ沉積和降低血清中的外泌體水平[39]。

實驗表明，有氧運動訓練歷時150 d后的轉基因組小鼠(APP/PS1)認知功能顯著超過對照組；其腦內的Aβ淀粉樣斑塊顯著減少，Aβ代謝關鍵酶β- 淀粉樣前體蛋白裂解酶1蛋白水平顯著下降，ADAM10蛋白水平明顯提高，提示運動訓練可能促進了腦內Aβ的代謝[40]。另外，小鼠腦內多囊泡體水平明顯升高，提示運動訓練可能促進外泌體的產生和釋放[40]。

5 小 結

外泌體的生物利用度及其內在的生物特性使得它們成為很有潛力的治療方式，外泌體進入細胞有多種路徑,每一種進入方式均需評估其是否是最有效的一種方式，而外泌體可以被設計以“編碼”的方式進入[41]。但利用外泌體進行生物治療仍存在很多問題，如外泌體的承載能力及其內容物的半衰期需要明確；要從藥理學的方面考慮外泌體的劑量和生物學分布；外泌體在受體細胞的攝取動力學；外泌體的治療性遞送是否需要囊泡表面有配體，以提高靶目標的結合、增加遞送的成功率等。未來對外泌體生物學的深入研究，將為AD的治療提供新思路。