外泌體與子代神經精神疾病診治的研究進展

楊燕平，常清賢

(南方醫科大學南方醫院婦產科，廣州 510515)

產前多種不良因素可引起胎兒大腦神經發育異常，從而增加子代神經精神疾病的發病風險[1]。子代神經精神疾病潛伏期長，通常在發病的數年后診斷，缺乏客觀和敏感的早期診斷指標[2]。因此，如何在臨床癥狀出現前早期診斷、干預和治療至關重要。外泌體是一種具有脂質雙層結構的納米級細胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)，直徑為40～120 nm。20世紀80年代，外泌體首先在網織紅細胞中被發現，后被命名為“exosome”,隨后發現神經細胞、間充質干細胞等多種類型的細胞均可分泌外泌體到細胞外環境。外泌體內含蛋白質、脂質以及RNAs等多種活性分子，介導體內不同類型細胞間的通訊，從而影響機體生理和病理狀態[3]。作為一種新型的細胞間通訊方式，外泌體可靶向運輸特異性蛋白質及微RNAs(microRNAs,miRNAs)等遺傳物質，參與胚胎神經發育及神經精神疾病如自閉癥、精神分裂癥等的病理生理過程[4-5]，發揮調控基因轉錄、表達、傳遞信息載體的作用，是近年來研究的熱點。外泌體廣泛存在于血液、母乳、尿液、羊水、腹水、腦脊液等生物體液中[6-7]。研究表明，胎兒神經源性外泌體在妊娠早期約6周即可在母體外周血循環中檢測到，其是一種非侵入性的早期診斷和評估胎兒神經發育及腦損傷的方法[2,8]，可能是潛在的生物標志物，具有廣闊的臨床應用前景，可為疾病的預防、早期診斷以及靶向治療提供新思路。現就外泌體與胚胎神經發育及子代神經精神疾病的關系的研究進展予以綜述。

1 外泌體概述

1.1外泌體的形成和釋放 外泌體主要通過內吞體分選轉運復合體途徑由細胞多泡體(multivesicular body,MVB)內出芽形成[6]。外泌體胞膜由鞘磷脂、膽固醇、富含神經酰胺的脂筏等組成，形態規則，大小相對一致，電鏡下呈杯狀半透明結構[3]。MVB可分為分泌型和降解型兩種。在分泌型MVB中，4種蛋白復合體及輔助蛋白共同參與形成MVB，然后與細胞膜融合向細胞外環境釋放外泌體。在降解型MVB中，內體囊泡與內體腔膜融合，隨后與溶酶體融合降解形成外泌體。目前尚無能夠識別分泌型MVB和降解型MVB的蛋白標志物。此外，可能還存在其他非依賴內吞體分選轉運復合體的途徑，包括神經酰胺、熱激蛋白等。外泌體的形成和釋放受多種因素的影響，如GTP酶、MVB錨定機制、Rab家族因子等[9-10]。

1.2外泌體的內容物及特點 外泌體包含蛋白質、脂質以及miRNAs等多種活性內容物,可以靶向傳遞活性內容物給目標細胞或器官，發揮調節基因轉錄、表達等作用，實現細胞間遺傳物質的交換[10]，但具體機制尚不明確。外泌體的雙層脂質膜可以保護攜帶的活性內容物在細胞釋放后避免體內通路和RNA酶的降解，同時逃避免疫系統的影響，因此外泌體有良好的循環穩定性，且易通過血腦屏障、血腦脊液屏障、胎盤屏障等生物屏障[11-14]。

1.3外泌體在神經細胞通訊中的作用 外泌體在神經細胞間的通訊中發揮著重要作用，如在神經元與神經元、神經膠質細胞與神經元之間傳遞信號，促進神經軸突再生，增加神經元活性，維持神經系統結構和功能的完整性；神經元去極化后分泌的外泌體在突觸間選擇性修剪非活性突觸，調節神經突觸的可塑性[13]；促進神經元分化，缺氧和饑餓狀態下的神經膠質細胞來源的外泌體具有神經保護作用[5]。

2 外泌體與胚胎神經發育

外泌體在神經細胞間傳遞信息，與神經發育及功能密切相關[4]。幾乎所有的神經細胞都能釋放出miRNAs，其中大部分被包裹在EVs,包括外泌體中，并能在生物液體中檢測到[2,8,12]。妊娠6周時就可以在孕婦循環中檢測到胎盤源性外泌體，是非妊娠女性的50倍[15]。外泌體在母胎通訊交流過程中維持胎盤穩態[16]，參與胎兒神經發育[8]、妊娠相關疾病[15]及自閉癥等[13]的多種生理及病理過程。

2005年首次在小鼠胚胎腦發育過程中發現神經管腔外泌體的存在[17]，隨后發現，神經膠質細胞衍生的外泌體可促進神經細胞的生長和存活。Feliciano等[18]研究表明，人類胚胎神經干細胞源性外泌體攜帶特異性miRNAs和蛋白質，可激活胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)通路，促進神經干細胞擴增。神經源性外泌體在神經細胞間傳遞信號，對神經發育的影響主要取決于內容物。腦組織中富含miRNAs，其在轉錄后水平負調控基因的表達，對腦神經發育和分化過程以及神經細胞功能起關鍵作用[8,19]。

Moreau等[20]通過RNA測序技術對胎兒、產后早期以及成人的腦組織進行檢測發現了人類大腦發育過程中不同miRNAs的時間表達譜。研究顯示，miRNAs在胎兒、早期出生后以及成年腦組織中的表達特征顯著不同，大腦發育相關的特異性miRNAs如miR-124和miR-9在胚胎神經發育早期表達上調，而部分miRNAs在出生后表達下調。與自閉癥、精神分裂癥以及抑郁癥等相關的基因組中，差異表達的miRNAs靶點高度富集[21]。進一步研究顯示，孕婦妊娠期在不利的環境因素或緊張經歷作用下可通過改變表觀遺傳調控機制如miRNAs的表達、DNA甲基化以及組蛋白修飾，影響胎兒的內分泌機制和大腦發育過程，增加子代神經和精神疾病的發生風險[2]。除miRNAs外，外泌體也含有豐富的蛋白質，如熱激蛋白、四次跨膜蛋白，參與細胞間通訊[7]。在整個發育過程中，基因表達受到一系列進化保守蛋白如Notch、Wnt、轉化生長因子-β等的調控[6]。

3 外泌體在神經精神疾病中的診斷作用

3.1自閉癥譜系障礙(autism spectrum disorder，ASD) ASD是目前最熱門的研究領域之一，是以持續的社會缺陷和有限重復的行為模式為核心癥狀的一組神經發育障礙[4]。Goetzl等[8]研究顯示，可從孕婦血漿中分離提純出胎兒神經源性外泌體，胎兒神經源性外泌體的相對比例、絕對數量及神經細胞類型隨妊娠期階段的改變而改變，而在非妊娠期孕婦的血漿中無法檢測到，提示胎兒神經源性外泌體可作為妊娠早期無創評估不良因素宮內暴露，造成胎兒神經發育障礙的一種強有力的工具，最終降低子代ASD的發生率。ASD患者組織或血清中miRNAs的水平會發生改變[22]，而循環中的miRNAs非常穩定，可作為一種非侵入性的診斷標志物[23]。另一研究顯示，ASD患者血清中差異表達的miRNAs(如hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-328)預測靶基因富集于ASD相關的神經通路，提示hsa-miR-181b-5p等miRNAs可能是ASD相關的潛在的早期診斷生物標志物[4]。綜上，檢測孕婦循環中胎兒神經源性外泌體或差異表達的特異性miRNAs可作為早期診斷宮內胎兒神經發育情況及評估ASD發病風險的無創性方法之一。但目前缺乏關于miRNAs參與ASD的直接證據，尚需進一步研究明確相關的特異性外泌體源性miRNAs[22]。

3.2精神分裂癥 精神分裂癥是一種嚴重的精神障礙，以妄想、幻覺等行為異常、運動能力受損及認知缺陷為特征，影響著全世界1%的人群，發病率和死亡率逐年升高[24]。一項薈萃分析顯示，產科并發癥如妊娠期糖尿病、先兆子癇等可增加胎兒出生后精神分裂癥的風險[25]。在精神分裂癥患者中，特異性外泌體源性miRNAs(miR-497)差異表達顯著增加[24]。此外，循環中的miRNAs參與了精神分裂癥的病理過程，并可作為循環生物標志物[26-27]。在一項涉及330例精神分裂癥患者和202例健康者的薈萃分析中，精神分裂癥患者外周血單核細胞中差異表達的miRNAs(如miR-181b-5p等)診斷精神分裂癥的敏感性和特異性均較高，提示可作為診斷精神分裂癥的生物標志物[27]。目前外泌體源性miRNAs與精神分裂癥之間的具體關系還不明確，即外泌體源性miRNAs的變化是精神分裂癥發病機制的一部分，還是一種適應性代償改變，尚需行進一步的大樣本研究證實。

3.3其他神經系統疾病 阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種常見的神經退行性疾病，是以記憶力減退和認知能力下降為特點的復雜疾病。血液中神經源性外泌體中Tau蛋白(如P-S396-tau)的水平變化可在臨床發病前早期預測AD的發生[28]。研究表明，體液中神經外泌體源性miRNAs已成為解決AD患者早期診斷困難的有力工具[13,29]。此外，在神經系統腫瘤方面，腫瘤相關的特異性miRNAs、長鏈非編碼RNAs等可作為新型生物標志物，前景良好。外泌體可從癌癥患者的血清或腦脊液中分離出來，其中神經腫瘤來源的外泌體 miRNAs 的表達水平與腫瘤的診斷具有顯著的相關性[30]。相比傳統的影像學或病理學方法，生物體液來源的神經腫瘤外泌體及其攜帶的內容物(特異性miRNAs等)是一種快速、低侵入性、可靠的生物標志物。以上方法均起到液體活檢的作用，可減少或避免外科手術、腦組織活檢等侵入性檢查[30]。

4 外泌體在神經精神疾病治療中的作用

4.1潛在的治療靶點 AD的主要病理特征是病理性Tau蛋白的積累，在疾病早期Tau蛋白從內嗅皮質傳播到海馬區。小膠質細胞是大腦中主要的吞噬細胞，與病理性Tau蛋白的傳播累積過程具有相關性，但它們是如何參與Tau蛋白傳播的尚不清楚。Asai等[31]的研究顯示，在AD中小膠質細胞通過外泌體分泌傳播Tau蛋白，并且抑制外泌體的合成可顯著減少蛋白Tau在體內外的繁殖傳播，表明外泌體分泌途徑可能是治療AD的靶點。體外實驗顯示，人類脂肪細胞中的間充質基質細胞可分泌含有功能性腦啡肽酶的外泌體，降解已分泌的和細胞內的β淀粉樣蛋白[32]。研究發現，將載有針對AD治療靶點BACE1(編碼β分泌酶1)的內源性小干擾RNAs的外泌體注入野生型小鼠中，可觀察到BACE1明顯下調，這表明外泌體可作為治療AD的一種新途徑[32]。改變大腦中特定的miRNAs的水平可改變行為[23]，如輸注含有小干擾RNA的外泌體可使亨廷頓患者35%的miRNAs沉默表達，從而使其行為表現改變。此外，基于外泌體的腫瘤免疫療法有望將外泌體作為“疫苗”用于預防傳染性疾病或胎兒疾病的宮內治療[23]，但目前還缺乏臨床實驗數據。

4.2新型藥物傳送載體 納米技術的發展為疾病的診治提供了新方法。與傳統合成的納米輸送系統相比，外泌體循環穩定、免疫原性低、生物相容性和生物屏障通透性好[11]。來自成人干細胞的外泌體有望成為向大腦輸送治療藥物，從而治療腦部疾病的一種新策略。間充質基質細胞是一種可以從多種組織中分離出來進行細胞培養的具有自我更新能力的多能祖細胞，在不同因素作用下可產生大量具有不同特征的外泌體[33]。外泌體可在細胞間穿梭輸送RNAs，并在受體細胞中翻譯，產生特定的蛋白質，提供重要信號，進而調節受體細胞的功能[10]。間充質干細胞或生物工程組裝的外泌體可作為腫瘤藥物治療的載體[11]，可降低致瘤風險，發揮抗癌或抑制化療耐藥的作用，可作為下一代新型藥物輸送系統的候選載體[34]。作為新型的基因傳遞載體，外泌體為疾病的基因治療提供了新途徑[35]。外泌體有獨特的優勢，既可通過多種生物屏障，又能發揮多種細胞間遺傳通信，可發生在微環境中，也可發生在遠處，即外泌體以類似激素的方式在體循環中輸送通訊信號進而影響受體細胞的功能。外泌體能夠遠距離將核酸傳遞給細胞的能力也使其成為基因治療的理想載體，有望成為用于靶向治療胎兒發育異常及相關疾病的一種新型的內源性天然藥物載體，從而減少藥物對母體造成的不良影響。目前也存在一些問題，如缺乏統一的外泌體分離和量化方法、潛在的不良反應，未來需進一步大樣本臨床研究去驗證[34]。

4.3監控病情狀態或進展 生物體液中的外泌體攜帶著特異性活性物質，可作為監測神經疾病狀態的一種有效手段。研究表明，AD患者外泌體中的磷酸化Tau和β淀粉樣蛋白1-42水平的升高可幫助監測AD患者的疾病狀態[28]。另一項研究通過分析ASD與健康者尿液中的微生物群及其外泌體發現，與健康對照組相比，ASD組中微生物群的分布發生了顯著變化，提示ASD患者尿液中細菌來源的外泌體可作為快速評估ASD患者微生物群改變以及監測ASD患者行為的有效工具[36]。胎兒DNA可穿過胎盤在妊娠早期母體的循環血中被提取分離出來，從母體血漿中分離純化的特異性的胎兒神經源性外泌體可作為妊娠早期監測胎兒神經發育的一種有效指標。此外，中樞神經系統腫瘤相關特異性外泌體可用于監測癌癥進展或新出現的耐藥細胞，為疾病的精準預測、治療和干預提供新途徑[31]。但目前外泌體尚處于初步研究階段，有待進一步臨床驗證。

4.4再生醫學的應用 目前干細胞治療已經成為改善心肌梗死后心臟重塑的一種潛在方法。胎兒和圍生期心臟干細胞或小兒心臟祖細胞來源的外泌體具有取材容易、自我更新強以及無瘤性的特性，具有促進心肌再生、修復以及改善心臟功能的作用[37-38]。CD34+細胞、胚胎干細胞、間充質干細胞等多種類型細胞來源的外泌體可通過旁分泌或其他潛在機制減少血管纖維化、促進血管修復，進而改善心肌功能。目前關于胎兒神經系統再生的研究相對較少，且主要基于體外實驗。胚胎、臍帶等多種來源的間充質干細胞外泌體具備多向分化、免疫排斥小、致瘤風險小等優點，可用于神經組織的再生修復[39]。對腦卒中動物模型的研究顯示，間充質干細胞衍生的外泌體可誘導神經功能恢復和神經血管重塑，促進神經再生，為干細胞治療疾病提供新思路[40]。

5 小 結

外泌體作為一種新的細胞間通訊方式和載體，在胚胎神經發育和子代神經精神疾病的診治中發揮著重要作用。目前大部分研究基于體外試驗，且部分研究結果不一致，因而需要大樣本的體內和體外實驗去驗證[11,34-35]。外泌體具有廣闊的臨床應用前景，現代技術的發展及研究的深入將為解決臨床問題提供新的思路和依據。未來的研究方向可能包括：①利用生物信息分析學或下一代基因測序技術等從分子或基因水平探討外泌體與母胎疾病發病機制的關系；②探索外泌體相關的母胎疾病治療新靶點及新型藥物載體以研發新藥物；③尋找特異性的外泌體生物標志物用于疾病的早期診斷或病情監測；④基于外泌體的再生醫學或宮內基因治療，治療胎兒或嬰兒某些先天神經發育缺陷或畸形，進行精準治療和個性化治療。