HPLC法同時測定牛黃清感膠囊中8種有效成分的含量

莊 巖，遆鐵軍，霍金海，朱立剛，趙雪瑩，周有財，王偉明

（1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院 中藥研究所，哈爾濱 150036；2.黑龍江澳利達(dá)奈德制藥有限公司，哈爾濱 150001；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040）

牛黃清感膠囊是由黃芩、金銀花、連翹、人工牛黃、珍珠母等5味藥材組成，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒的功效，用于外感風(fēng)寒所致的感冒發(fā)熱，咳嗽，咽痛[1]。研究發(fā)現(xiàn)其對甲型H3N2流感病毒具有抑制和預(yù)防的作用，對呼吸道合胞病毒（RSV）具有極強(qiáng)的預(yù)防作用，并且具有較好的臨床療效[2-3]，為了更好的把控制劑質(zhì)量，尤其是加強(qiáng)黃芪，金銀花，連翹主要藥味的質(zhì)量控制。筆者建立了牛黃清感膠囊的HLPC法同時測定牛黃清感膠囊中8種成分的含量測定[4-9]，從而對牛黃清感膠囊進(jìn)行更全面的質(zhì)量控制[10]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Waters Alliance 2695系統(tǒng)，含四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱以及Waters Empower色譜工作站，Waters二極管陣列檢測器（PDA 996）；Agilent C18（2）100A（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱。

1.2 試劑與樣品 綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸C、連翹酯苷A、漢黃芩苷、漢黃芩素對照品（批號分別為 L-007-160504、Y-067-160715，Y-070-161102、L-012-160603、H-019-161031、H-029-140729，均來自成都瑞芬思生物科技有限公司），黃芩苷對照品（批號110715-201016，中國食品藥品檢定研究院），黃芩素對照品（批號111595-200905，中國食品藥品檢定研究院），甲醇、乙腈為色譜純（Merck公司），磷酸為分析純，水為超純水；黃芩、連翹及金銀花藥材購于哈藥集團(tuán)世一堂中藥飲片有限責(zé)任公司；牛黃清感膠囊由黑龍江奧利達(dá)奈德制藥有限公司（批號為 17010301，17010302，17020301，17020303，17030303）。

2 實驗方法

2.1 供試品的制備 取牛黃清感膠囊內(nèi)容物3 g，精密稱定，加甲醇25 mL，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻濾過，取續(xù)濾液，即得。

表1 各成分線性回歸方程

表2 牛黃清感膠囊8種成分含量

圖1 牛黃清感膠囊中金銀花成分含量測定結(jié)果

2.2 液相色譜條件Agilent C18（2）100A色譜柱：（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.5%磷酸溶液（B）進(jìn)行梯度洗脫，0～5 min，5%A～5%A，5～15 min，5%A～10%A，15～20 min，10%A～14%A，20～50 min，14%A～18%A，50～70 min，18%A～25%A，70～85 min，25%A～30%A，85～110 min，30%A～50%A，體積流量1 mL/min檢測波長350 nm，柱溫40℃。理論板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于2 000。對照品溶液、樣品溶液及各陰性樣品溶液見圖1-3。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸，隱綠原酸，異綠原酸C，連翹酯苷A，黃芩苷，黃芩素，漢黃芩苷和漢黃芩素對照品適量，加甲醇溶解，分別制成綠原酸 300 μg/mL、隱綠原酸 200 μg/mL、異綠原酸 C 206 μg/mL、連翹脂苷 A 203 μg/mL、黃芩苷204 μg/mL、黃芩素 203 μg/mL、漢黃芩苷 200 μg/mL、漢黃芩素206 μg/mL的溶液，作為對照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實驗 取牛黃清感膠囊樣品（批號17030303），按“2.3”項方法制備對照品溶液，精密吸取對照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。計算8個色譜峰的峰面積及保留時間，結(jié)果表明8個對照品色譜峰面積及保留時間的RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性實驗 取牛黃清感膠囊樣品（批號17030303），分別于制備后 0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，共記錄6個時間點的圖譜。結(jié)果色譜峰面積的RSD小于2.0%。結(jié)果表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性實驗 取牛黃清感膠囊樣品（批號17030303），按“2.1供試品溶液的制備”項下平行制備6份供試品溶液，依法測定8個色譜峰的峰面積，結(jié)果峰面積的RSD小于2.0%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

圖2 牛黃清感膠囊中黃芩成分含量測定結(jié)果

2.4.4 加樣回收率實驗 精密稱取“2.1”項已測知含量樣品約1.5 g，分別加入一定量的綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸C、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、連翹、對照品，按照“2.1”項下方法制備供試溶液，進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測定，結(jié)果綠原酸、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、連翹酯苷A的平均回收率分別為 99.6%、99.3%、100.5%、100.2%、99.6%、100.7%、99.5%、99.2%。

圖3 牛黃清感膠囊中連翹成分含量測定結(jié)果

2.4.5 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液1、3、5、10、15、20 μL 進(jìn)樣測定；以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得隱綠原酸，綠原酸，異綠原酸C，連翹酯苷A，黃芩苷，黃芩素，漢黃芩苷和漢黃芩素苷的線性回歸方程見表1。

2.4.6 陰性樣品溶液的制備 按2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的牛黃清感膠囊制備方法分別制備缺少金銀花、黃芩、連翹的陰性樣品，按“2.1”項方法操作，即得陰性樣品溶液。

3 樣品含量的測定

取5批樣品按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以外標(biāo)法計算待測成分含量見表2，結(jié)果表明綠原酸，隱綠原酸，異綠原酸C，連翹酯苷A，黃芩苷，漢黃芩苷、黃芩素的含量均值分別為 1.139、2.793、2.631、31.695、93.123、1.903、0.440、0.305 mg/g。

4 討論

本實驗在流動相選擇時，以甲醇－0.1%冰醋酸溶液、甲醇－0.5%磷酸溶液、乙腈－0.5%磷酸溶液等3種流動相系統(tǒng)分別進(jìn)行試驗，其中，乙腈－0.5%磷酸溶液分離效果最好。波長在254 nm條件下，黃芩苷峰過大，不易分開，波長350 nm下各峰比例良好，峰與峰間距良好，易于分辨，故確定350 nm為最佳測定波長。為保持色譜分析的一致性，設(shè)定柱溫來控制不同實驗環(huán)境下的色譜分析，分別考察了25、30、35、40 ℃柱溫下的分離情況，結(jié)果表明，柱溫40℃時分離效果較好。最終，建立牛黃清感膠囊的HLPC法同時測定牛黃清感膠囊中8個成分的含量。不同流動相的色譜圖。

5 結(jié)論

中藥含量測定[11-16]是一種綜合的，可量化的鑒定手段，它是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，主要用于評價中藥制劑質(zhì)量的真實性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性。

本實驗建立了HLPC法同時測定牛黃清感膠囊中8種有效成分的含量的測定方法。通過對精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率、線性關(guān)系和陰性樣品溶液的制備等方法學(xué)的考察，證明了通過對照品，對圖譜中的一些峰進(jìn)行定性定量分析，可以較為全面的反映了牛黃清感膠囊物質(zhì)基礎(chǔ)，為牛黃清感膠囊質(zhì)量控制提供了依據(jù)。