過氧化物還原酶3在胚胎停育患者絨毛及蛻膜組織中的表達變化

孫艷芬 張星瑩 李甜甜 李連芹

在我國，由于婚育年齡推遲、生活方式改變、環境污染加劇等因素，早期自然流產（發生于妊娠12周之前的流產）發生率呈上升趨勢。發生早期自然流產的原因很多，包括胚胎因素、母體因素、父方因素、環境因素（包括局部環境如子宮）[1]等。無論是母體因素、父方因素，還是環境因素所導致的自然流產，其中有一個環節與氧化應激狀態有關。研究表明自然流產患者的絨毛或血清均呈氧化應激狀態[2-3]。而生物體內存在多種抗氧化系統，以應對氧化應激狀態。其中過氧化物還原酶（peroxiredoxin，PRX）利用其自身的半胱氨酸殘基，將過氧化氫還原成水。PRX3作為該家族的成員之一，主要存在于線粒體中[4]，與硫氧還蛋白2、硫氧還蛋白還原酶2構成線粒體內的第一道抗氧化防線[5]。筆者團隊前期研究發現，早孕婦女絨毛組織和血清中PRX3表達水平均隨著孕周的增加而不斷升高，說明PRX3在孕早期即開始發揮抗氧化作用[6]。但是，目前尚不清楚PRX3與妊娠早期自然流產發生的關系。本研究通過比較胚胎停育患者與非胚胎停育患者絨毛及蛻膜組織中PRX3的表達變化，進一步探索PRX3在妊娠中的抗氧化功能，并從新的角度探討胚胎停育的發病機制。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2017年12月至2018年5月因胚胎停育實施人工流產的患者60例作為胚胎停育組，同期因意外懷孕要求終止妊娠的非胚胎停育患者60例作為對照組。人工流產術后，均無菌操作留取兩組患者的絨毛及蛻膜組織。兩組患者年齡、BMI、孕周、胎芽大小比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。本研究經濱州醫學院醫學倫理委員會批準和患者知情同意。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 主要試劑和儀器 實時定量PCR SYB Green試劑盒購自日本TaKaRa公司，第一抗體兔抗PRX3多克隆抗體、兔抗β-actin多克隆抗體、第二抗體生物素標記的羊抗兔IgG購自英國Abcam公司，硝酸纖維素膜購自美國Millipore Corporation公司，ECL化學發光試劑盒購自英國Amersham公司。Gel-Pro Analyzer購自美國Media Cybernetics公司，提取RNA用Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，蛋白測定試劑盒、PCR擴增儀（Bio-Rad iCycler）購自美國 Bio-Rad公司，TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 絨毛及蛻膜組織中PRX3 mRNA表達水平檢測采用實時定量PCR法。將絨毛及蛻膜組織洗凈后剪碎，采用Trizol法提取絨毛及蛻膜組織總RNA，將RNA反轉錄為cDNA。實時定量PCR反應條件：95℃ 3min，（95℃ 15s，60℃ 60s）×40 個循環；反應體積為 50μl。以β-actin為內參。PRX3上游引物：5′-CAGCCGTTGTCAATGGAGAG-3′， 下 游 引 物 ：5′-TCACATCGTGAAATTCGTTAGC-3′；β -actin 上 游 引 物 ：5′-CGGCCAGGTCATCACCATTG-3′，下游引物：5′-CCGCCAGACAGCACTGTGTTG-3′。相對表達量以公式 2-ΔCt×106計算，其中 Ct=（CtPRX3-Ctβ-actin）。

1.3.2 絨毛及蛻膜組織中PRX3蛋白表達水平檢測采用Western blot法。將絨毛及蛻膜組織剪碎，勻漿器勻漿后加入適量裂解液裂解約30min，在4℃條件下以12 000rpm離心5min，吸取上清液分裝于0.5ml離心管中。利用蛋白測定試劑盒檢測蛋白質濃度后，取等量的上清液樣品用15%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉到硝酸纖維素膜上。第一抗體稀釋濃度為1∶2 000，第二抗體稀釋濃度為1∶1 000，用ECL化學發光試劑盒顯色。將膠片放入機器進行掃描，利用Gel-Pro Analyzer分析判讀目標帶的分子量和積分光密度值（integrated optical density，IOD），通過比較目標蛋白PRX3與內參蛋白β-actin的IOD值，獲知PRX3的相對表達量。

1.4 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者絨毛及蛻膜組織中PRX3 mRNA表達水平比較 胚胎停育組患者絨毛及蛻膜組織中PRX3 mRNA表達水平均高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 2。

表2 兩組患者絨毛及蛻膜組織中PRX3 mRNA表達水平比較

2.2 兩組患者絨毛及蛻膜組織中PRX3蛋白表達水平比較 胚胎停育組患者絨毛及蛻膜組織中PRX3蛋白表達水平均高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 3。

表3 兩組患者絨毛及蛻膜組織中PRX3蛋白表達水平比較

3 討論

本研究結果表明，胚胎停育患者絨毛及蛻膜組織中PRX3 mRNA和蛋白表達水平均升高，說明在胚胎停育患者絨毛及蛻膜組織中存在氧化應激狀態，同時也說明PRX3在應對胚胎停育患者的氧化應激狀態方面，發揮積極作用。

PRX3作為線粒體內的抗氧化蛋白，可以清除線粒體內90%的過氧化氫，在維持線粒體的功能穩定方面發揮重要作用[5]。本研究發現胚胎停育患者絨毛組織中PRX3 mRNA和蛋白表達水平均高于同期正常妊娠的絨毛組織。推測胚胎停育患者絨毛組織所產生的活性氧自由基過多，超出了機體清除氧化物的能力，因而PRX3的表達反應性上調，以緩解氧化應激狀態。這一結果表明在應對胚胎停育患者的氧化應激狀態方面，PRX3的作用同樣重要。如前所述，引起自然流產的因素包括胚胎因素、母體因素、父方因素、環境因素等。在發病機制方面，其中的作用環節與氧化應激狀態有關[7-8]。氧化應激狀態通過影響孕囊著床、胚胎和胎盤發育、胎盤血管生成與血流分布等，成為自然流產的發病機制之一[9-10]。關于氧化應激發生的原因，日本學者Ishii等[11]利用轉基因小鼠所做的動物實驗研究發現，當線粒體的呼吸鏈發生異常時，會出現一種慢性的氧化應激狀態，進而影響小鼠的生殖功能和妊娠結局，包括不孕不育、自然流產、復發性流產、甚至母體死亡。進一步研究發現，這種轉基因小鼠的胎盤血管發育不良，導致胎盤的炎癥反應和胚胎的血管生成異常。伊朗學者Gharesi-Fard等[12-13]報道，在患有自身免疫性疾病的復發性流產患者中，其胎盤和血清中均檢測到抗PRX3自身抗體，說明PRX3參與胚胎著床和胎盤形成。本研究中，胚胎停育患者蛻膜組織中PRX3的表達同樣升高，說明該類患者的宮腔內也存在氧化應激狀態。伊朗學者Rahiminejad等[14]對100例接受體外受精-胚胎移植的患者進行了研究，在胚胎移植前吸取子宮內膜分泌物（宮腔液）1～2ml，檢測其中的氧化應激狀態，包括超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性、脂質過氧化物水平、硫醇基化合物水平以及總的抗氧化能力。結果發現28例臨床妊娠患者宮腔液中抗氧化酶水平或者總的抗氧化能力明顯高于移植失敗或早期流產患者，說明子宮內膜的抗氧化酶活性對于維持妊娠非常重要。Liu等[15]研究發現，在早期自然流產的蛻膜細胞中，存在內質網應急和氧化應激狀態，并出現細胞凋亡征象，表現為內質網膨脹，Caspase-4和Caspase-12激活等，說明宮腔內的氧化應激狀態與自然流產的發生密切相關。

綜上所述，胚胎停育患者存在氧化應激狀態，PRX3作為線粒體內重要的抗氧化蛋白，在絨毛及蛻膜組織中的表達反應性升高，對于維持妊娠具有重要作用。換而言之，PRX3可能不是自然流產的致病因素，而是抑制自然流產進展的利好因素。對先兆流產患者補充抗氧化劑，可能有利于改善妊娠結局。關于PRX3在自然流產中的作用機制，尚需要進一步研究。