巨噬細胞移動抑制因子基因多態性與子宮內膜異位癥的相關性研究

谷杭芝 林蒙蒙 林蓉蓉 戴張波 胡燕

子宮內膜異位癥是一種常見的婦科疾病，以宮腔以 外部位（卵巢、大網膜、子宮直腸陷凹、腹壁、肺等）的活性子宮內膜細胞增殖、浸潤為特點，引起頑固性、進展性、慢性盆腔疼痛，可導致不孕、月經異常等。子宮內膜異位癥雖然是一種良性疾病，但也存在惡變的風險[1]。育齡期婦女子宮內膜異位癥發病率接近5%～10%，而近年來卵巢型子宮內膜異位癥發病率有明顯上升趨勢。手術是治療子宮內膜異位癥的主要手段，但復發率高，嚴重影響育齡婦女的身心健康。巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一種可溶性細胞因子，其在子宮內膜異位癥患者的腹腔液、血清、異位內膜組織中均呈高表達[2-4]。本研究采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性分析（polymorphism chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis，PCR-RFLP）技術對MIF基因多態性進行分析，探討其與子宮內膜異位癥遺傳易感性的關系，以期為子宮內膜異位癥的發生機制及早期診斷提供依據。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2014年3月至2015年7月在本院婦科接受腹腔鏡手術的卵巢型子宮內膜異位癥患者150例作為病例組，術后標本均經病理學檢查證實為子宮內膜異位癥，年齡 21～46 歲，中位年齡 35（26，37）歲。選取同期本院健康體檢者或因其他原因進行腹腔鏡手術的患者150例作為對照組，通過詢問既往史結合相關化驗檢查后排除子宮內膜異位癥，年齡20～50歲，中位年齡29（25，36）歲。兩組受試者年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05），彼此之間無血緣關系，無婦科良、惡性腫瘤，無糖尿病、甲狀腺功能異常等內分泌疾病，家族史中無遺傳病，無肝炎、結核等感染性疾病，無類風濕性關節炎及其他自身免疫性疾病，近期未服用過激素類藥物。本研究經醫院倫理委員會批準和患者本人或其家屬同意。

1.2 試劑與儀器 血液基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、50bp DNA ladder、100bp DNA ladder、DNA loading buffer購自天根生化科技（北京）有限公司，限制性內切酶 AluⅠ、HaeⅢ、HpaⅡ購自 NEB（北京）有限公司，紫外分光光度計購自美國Thermo公司，電泳儀購自北京百晶生物技術有限公司，PCR擴增儀購自德國Mastercycler Gradient Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取 無菌操作下采集外周靜脈血至少5ml，加入內置有0.85ml枸櫞酸鈉的試管中，混勻，放置于4℃冰箱保存備用（1周內檢測）。采用血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組NDA。

1.3.2 引物設計 搜索NCBI網站，獲取人MIF基因的序列及 MIF-rs4822446 A/G、rs4822443 G/A、rs2012133 G/C位點序列。將MIF基因的序列導入Primer Premier 5軟件中，使用Primer功能設計位于各基因位點上下游的引物序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。

表1 各位點引物序列

1.3.3 基因多態性檢測 采用PCR-RFLP技術檢測MIF-rs4822446 A/G、rs4822443 G/A、rs2012133 G/C 位點基因多態性。PCR反應體積為20μl體系，其中模板1μg，上游引物 1μl，下游引物 1μl，2×Taq PCR Master－Mix 10μl，雙蒸水補足至 20μl。酶切體系為：PCR 擴增產物 2.5μl、10×Buffer 1μl、三蒸水 6.3μl、限制性內切酶0.2μl，恒溫水浴4h。將酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳，電腦成像系統成像分析。各位點限制性內切酶及其酶切產物長度見表2。

表2 各位點限制性內切酶及其酶切產物長度

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗；對照組各位點基因型頻率的觀察值與預期值行Hardy-Weinberg平衡檢驗。采用logistic回歸分析計算等位基因和基因型的OR值和95%CI。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組Hardy-Weinberg平衡檢驗 對照組MIF-rs4822446 A/G、rs4822443 G/A、rs2012133 G/C 位點中基因型頻率觀察值與預期值間均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05），表明本實驗對照組資料具有群體代表性。

2.2 酶切結果 MIF-rs4822446 A/G位點經特異引物進行PCR后得到326bp大小的DNA雙鏈，經AluⅠ酶切后，GG型可見1條326bp大小的條帶，AA型可見1條200bp和1條126bp大小的條帶，GA型同時可見上述3條條帶，見圖1。MIF-rs4822443 G/A位點經特異引物進行PCR后得到326bp大小的DNA雙鏈，經HaeⅢ酶切后，AA型可見1條326bp大小的條帶；GG型被酶切成1條298bp和1條38bp大小的條帶，而38bp大小的條帶較小，因此在電泳圖上GG型僅見到1條298bp大小的條帶；GA型可見1條326bp和1條298bp大小的條帶，見圖2。MIF-rs2012133 G/C位點經特異引物進行PCR后得到793bp大小的DNA雙鏈，經HpaⅡ酶切后，CC型可見1條209bp和1條584bp大小的條帶，GG型僅見1條793bp大小的條帶，CG型同時可見上述3條條帶，見圖3。

圖1 MIF-rs4822446 A/G位點酶切產物電泳圖（1為GG型；2為GA型；3為AA型）

圖2 MIF-rs4822443 G/A位點酶切產物電泳圖（1為GG型；2為GA型；3為AA型）

圖3 MIF-rs2012133 G/C位點酶切產物電泳圖（1為CC型；2為CG型；3為GG型）

2.3 兩組多態性位點等位基因、基因型頻率分布 兩組受試者MIF-rs4822446 A/G位點的等位基因和基因型頻率比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。兩組受試者MIF-rs4822443 G/A位點的等位基因和基因頻率比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），其中攜帶A等位基因的婦女患子宮內膜異位癥的風險較攜帶G等位基因的婦女高（OR=1.145，95%CI：1.053～1.246，P＜0.05）。兩組受試者MIF-rs2012133 G/C位點的等位基因和基因頻率比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），其中攜帶C等位基因的婦女患子宮內膜異位癥的風險較攜帶G等位基因的婦女高（OR=1.208，95%CI：1.038～1.407，P＜0.05），見表 3。

表3 兩組多態性位點等位基因和基因型頻率分布比較[例（%）]

3 討論

子宮內膜異位癥目前最經典的病因學說就是Sampson提出的經血逆流學說[5]，而在實際的臨床觀察中發現，接近90%的育齡期婦女都會出現經血逆流，而只有10%會發展成子宮內膜異位癥[6]。子宮內膜異位癥是一種多基因遺傳疾病，攜帶突變基因的患者子宮內膜細胞更具有黏附和宮外生長的活性[7]。目前有較多研究將關注點聚焦于MIF上，其在子宮內膜異位癥發病中作用的研究已日益受到重視。人的MIF基因長度＜1kb，位于22號染色體長臂（2Zql1.2）的保守區內，由3個外顯子和2個內含子組成。MIF含有115個氨基酸殘基，相對分子質量約為12.5kDa[8]。國內外許多研究表明MIF在子宮內膜異位癥患者的腹腔液、血清、異位內膜組織中均呈高表達[2-4]。李建等[9]研究也證實以上觀點，并提出血清MIF水平在診斷子宮內膜異位癥中具有一定價值，與糖類抗原125聯合檢測可提高子宮內膜異位癥臨床診斷的特異度，有助于疾病的鑒別診斷。

目前MIF基因見報道較多的有4個多態性位點，它們分別位于啟動子區+656 C/G、+254 T/C、-173 G/C的3個單核苷酸多態性位點和-794的CATTn（n=5～8）微衛星多態性位點，研究表明MIF基因多態性與多種腫瘤的發病風險相關。有關MIF基因多態性與子宮內膜異位癥的關系研究報道較少。王春平等[10]研究發現MIF基因啟動子區-794 CATT微衛星多態性與廣東漢族人群子宮內膜異位癥的遺傳易感性相關，且CATT（5/5）基因型及CATT（5）等位基因型可能是其易感基因型。于雅等[11]研究發現MIF基因啟動子區+254 T/C位點多態性與子宮內膜異位癥發生的易感性有關，而C等位基因可能是其發生的遺傳易感標志。石瑾秋等[12]研究發現MIF基因啟動子區-173位點多態性與湖南漢族人群子宮內膜異位癥的遺傳易感性相關，其CC基因型可能是其易感基因。以上研究均提示MIF基因多態性與子宮內膜異位癥的遺傳易感性有關。然而不同研究者得出不同的基因多態性位點均可能是子宮內膜異位癥的易感基因，為進一步補充研究MIF基因多態性與子宮內膜異位癥的遺傳易感性關系，本研究從MIF-rs4822446 A/G、rs4822443 G/A、rs2012133 G/C 3個位點的多態性出發，通過PCR-RFLP技術發現MIF-rs4822443 G/A和MIF-rs2012133 G/C位點多態性與子宮內膜異位癥的發病風險有關，而MIF-rs4822446 A/G位點多態性與子宮內膜異位癥的發病風險無關。MIF-rs4822446 A/G位點A等位基因可能不是子宮內膜異位癥的易感基因。MIF-rs4822443 G/A位點攜帶有A等位基因的婦女患有子宮內膜異位癥的風險是攜帶G等位基因婦女的1.145倍。MIF-rs2012133 G/C位點攜帶有C等位基因的婦女患有子宮內膜異位癥的風險是攜帶G等位基因婦女的1.208倍。

綜上所述，本研究證實MIF-rs4822443G/A、rs2012133 G/C位點多態性與子宮內膜異位癥遺傳易感性有關，為臨床篩選高風險婦女提供了檢測依據。MIF-rs4822443 G/A位點攜帶有A等位基因和MIF-rs2012133 G/C位點攜帶有C等位基因的婦女MIF基因表達是否異常，是否與子宮內膜異位癥的發病機制有關，有待進一步研究證實。