紅景天苷對血管性癡呆大鼠學習記憶能力的改善作用及機制研究

王金華 張葉青 陶濤濤 柯博熙 張丹紅

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是由各種心、腦血管疾病導致的一種常見的臨床綜合征，患者主要表現為漸進性的認知功能下降[1]。近年來，VD發病率呈上升趨勢，已成為僅次于阿爾茨海默病的第二常見的癡呆類型[2]。目前，對于VD仍沒有特效的治療方法。紅景天苷是從傳統中藥紅景天中提取出來的一種化合物，具有多種藥物活性，如改善缺氧狀態、抗腫瘤、抗疲勞和抗毒性等作用[3-7]。同時，大量研究證實紅景天苷對于不同癡呆模型相關的認知功能具有明顯的改善作用[8-9]，但其作用機制仍不明確。本實驗采用雙側頸總動脈結扎法制作VD模型，并通過水迷宮實驗檢測大鼠認知功能的變化來評價紅景天苷對VD大鼠的治療效果，并探討其潛在機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選取雄性健康SPF級SD大鼠42只，體重230～280g，由河北醫科大學實驗動物中心提供。動物飼養在屏障環境內，動物房環境噪音低于60dB，室溫控制在20～25°C，相對濕度50%～70%，給予動物12h光照/12h黑暗交替的環境。所有動物自由獲取食物與飲用水。所有動物操作均嚴格遵守國際動物保護與使用指南的相關規定。

1.2 主要儀器和試劑 Morris水迷宮檢測系統購自上海欣軟信息科技有限公司，紅景天苷（ab120899，1mg），超氧化物歧化酶（SOD）（ab65354）、丙二醛（MDA）（ab118970）、TNF-α（ab100785）、IL-6（ab234570）ELISA試劑盒均購自英國Abcam公司。

1.3 大鼠VD模型建立 采用隨機數字表法將大鼠分為對照組、模型組和紅景天苷組3組，對照組大鼠12只，模型組和紅景天苷組各15只。模型組和紅景天苷組采用雙側頸總動脈結扎法制作VD模型，具體操作如下：每只大鼠于手術前12h開始禁食，可進水。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，麻醉劑發揮效果后將大鼠固定于操作臺上，消毒后沿頸部正中切開皮膚，顯露大鼠雙側頸總動脈，分離周圍組織后進行雙側頸總動脈結扎。術后對皮膚進行縫合并再次消毒，將動物放入籠中室溫下自然蘇醒，正常進食水。對照組給予同樣的操作，但只分離頸總動脈不進行結扎。紅景天苷組大鼠于造模后7d給予紅景天苷10mg/kg（1.5g溶于1L 0.9%氯化鈉溶液，6.7ml/kg）灌胃治療；對照組和模型組大鼠給予0.9%氯化鈉溶液（6.7ml/kg）灌胃，3組均為1次/d，連續4周。實驗過程中對照組大鼠無死亡，模型組和紅景天苷組各死亡3只，行水迷宮實驗時每組大鼠各12只。

1.4 水迷宮實驗檢測大鼠認知功能 紅景天苷治療4周后行水迷宮實驗檢測各組大鼠空間學習記憶能力的差異，水迷宮一人電腦操作，一人動物操作，均固定人員不變。水迷宮水池壁高為50cm，水深為40cm，水溫維持在20～24°C，水池直徑為150cm。在水迷宮的目標象限正中心位置放置一個直徑為10cm的水下隱性平臺，平臺上表面位于水下1cm處。前5d進行定位航行實驗，4次/d，每次從不同入水點放入大鼠。每只大鼠面朝水池壁放入池中，記錄逃避潛伏期，即大鼠尋找平臺的時間。若大鼠120s內未到達水下平臺，則將大鼠小心引導至平臺上，并讓其逗留15s，120s則為該大鼠逃避潛伏期時間。第6天，撤去水下平臺，記錄每組大鼠目標象限停留時間。水迷宮6d實驗方案見表1。

表1 水迷宮實驗方案

1.5 大鼠腦組織海馬MDA水平和SOD活性檢測 水迷宮實驗后，采用隨機數字表法每組選取5只大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后取腦組織，分離海馬，裂解后勻漿在4°C條件下使用離心機離心10min（12 000×g），留取上清液。采用ELISA法檢測大鼠腦組織海馬MDA水平和SOD活性。所有操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6 大鼠腦組織海馬TNF-α和IL-6水平檢測 水迷宮實驗后，采用隨機數字表法每組另選取5只大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后取腦組織，分離海馬，裂解后勻漿在4°C條件下使用離心機離心5min（12 000×g），留取上清液。采用ELISA法檢測大鼠腦組織海馬TNF-α和IL-6水平。所有操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.7 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠逃避潛伏期與目標象限停留時間比較與對照組相比，模型組和紅景天苷組大鼠逃避潛伏期均延長，目標象限停留時間均縮短，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與模型組相比，紅景天苷組大鼠逃避潛伏期縮短，目標象限停留時間延長，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 2。

2.2 各組大鼠海馬MDA水平和SOD活性比較 與對照組相比，模型組和紅景天苷組大鼠海馬MDA水平均升高，SOD活性均降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與模型組相比，紅景天苷組大鼠海馬MDA水平降低，SOD活性升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表3。

表2 各組大鼠逃避潛伏期與目標象限停留時間比較（s）

表3 各組大鼠海馬MDA水平和SOD活性比較

2.3 各組大鼠海馬TNF-α、IL-6水平比較 與對照組相比，模型組和紅景天苷組大鼠海馬TNF-α、IL-6水平均升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與模型組相比，紅景天苷組大鼠海馬TNF-α、IL-6水平均降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠海馬TNF-α、IL-6水平比較（ng/ml）

3 討論

VD是老年人癡呆的第二常見的病因，患者不僅記憶下降，執行功能也會出現嚴重受損[10]。高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥和高同型半胱氨酸血癥是VD的重要風險因素。目前對于VD的臨床治療仍無特效的治療方法。紅景天苷是紅景天的重要成分，具有多種藥物活性，如改善缺氧狀態、抗腫瘤、抗疲勞和抗毒性等作用[3-7]。

本研究發現，與對照組相比，VD大鼠逃避潛伏期明顯延長，目標象限停留時間明顯縮短，說明VD大鼠的認知功能與對照組相比明顯受損；經紅景天苷治療后，VD大鼠逃避潛伏期明顯縮短，目標象限停留時間明顯延長，提示紅景天苷可明顯改善VD大鼠空間認知功能的損害。

氧化應激是與腦卒中相關的神經損傷和認知功能障礙的調節劑，在大鼠腦梗死灶周圍出現氧化DNA損傷[11-13]。氧化應激不僅與VD有關，而且與VD的所有危險因素均有關。MDA、SOD在很多研究中被廣泛地用來代表氧化應激能力的水平[14-15]。在氧化損傷過程中，MDA水平增加被認為是脂質過氧化作用的一個特殊標志[16]。此外，氧化應激損傷可能會導致抗氧化防御系統的損傷，如SOD活性降低。研究發現VD患者較阿爾茨海默病患者顯示出更高水平的MDA[17]。本實驗發現VD大鼠海馬MDA水平升高、SOD活性降低，說明VD大鼠模型出現氧化應激損傷，這與之前的研究結果一致。紅景天苷治療后MDA水平和SOD活性發生了逆轉，證實了紅景天苷治療改善VD大鼠的空間學習記憶功能可能與其抗氧化應激損傷作用密切相關。

近年研究表明，異常的細胞因子網絡在卒中后的認知功能損傷中扮演著重要的角色。Zhang等[18]研究發現TNF-α可能會損害大鼠缺氧后突觸傳遞的恢復過程。TNF-α是一種促炎性細胞因子，主要由激活的噬細胞、T淋巴細胞和肥大細胞產生[19]。TNF-α是在激活宿主先天防御時首先產生的促炎性細胞因子，上皮和內皮細胞是其主要靶點[20]。TNF-α對目標細胞產生多重影響，包括刺激這些細胞產生和釋放多種炎性細胞因子[21]。有研究報道TNF-α與精神分裂癥患者的認知功能同樣也存在密切聯系[22]。IL-6是一種多功能的細胞因子，與宿主的先天防御和炎癥反應密切相關，在多種炎癥條件下，IL-6水平均會發生變化[23]。TNF-α、IL-6等促炎性細胞因子被認為與阿爾茨海默病和VD的發病機制息息相關[24]。Sudduth等[25]通過引發大腦神經炎癥，升高動物大腦中TNF-α、IL-6水平可成功誘導出高同型半胱氨酸血癥相關的VD模型。本實驗觀察到VD大鼠海馬TNF-α、IL-6水平均升高，紅景天苷治療后大鼠海馬TNF-α、IL-6水平均降低，提示紅景天苷治療對VD大鼠具有明顯的抗炎特性。

綜上所述，紅景天苷治療可明顯改善VD大鼠認知功能，降低MDA水平，升高SOD活性，抑制了VD大鼠海馬促炎性細胞因子TNF-α及IL-6的表達，其對VD大鼠發揮神經保護作用的機制可能與抗炎、抗氧化應激損傷作用密切相關。本實驗結果證實了紅景天苷治療對VD大鼠的神經保護作用，這為VD或其他類型癡呆的基礎和臨床治療提供一定的理論基礎。但本實驗發現紅景天苷治療未使VD大鼠的認知功能得到完全改善，也顯示了其治療的一定局限性，在今后的實驗中我們將會對其機制進一步深入研究。