結直腸癌大鼠熱創傷應激模型建立與評價

樊理華 李東麗 何佳群 武旖旎 韓新

結直腸癌是常見的惡性腫瘤，目前最有效的治療方法是廣泛性根治手術，但仍有50%的患者術后2年出現復發或轉移，其中約20%～30%的患者出現局部復發轉移，而50%～80%的患者發生遠處轉移[1-2]。手術本身是一種強烈的創傷應激，是增加腫瘤侵襲和轉移的主要原因之一[3]。但是目前還沒有一種理想的手術創傷腫瘤模型用于手術應激對腫瘤影響的研究，因而建立簡單有效的腫瘤創傷應激模型非常必要。本研究擬制備大鼠結直腸癌模型，在該模型基礎上予以特制的阻熱黃銅模板對大鼠進行熱創傷處理，建立大鼠熱創傷應激模型，旨在探索針對性的防治措施。

1 材料和方法

1.1 實驗動物條件 健康雄性SD大鼠72只，體重150～200g，購自溫州醫科大學實驗動物中心，本實驗獲得溫州醫科大學動物保護委員會批準。實驗前大鼠適應性喂養1周，自由獲取水和食物；動物房12h明暗周期循環（7：00～19：00給予光照），控制室溫為（21±2）℃、濕度60%。

1.2 試劑和儀器 N-甲基-N-亞硝基脲（MNU）（加拿大Toronto Research Chemicals公司），促腎上腺皮質激素（ACTH）（10817-09R）、IL-6（10926-09R）、IL-10（10542-09R）、皮質酮（10356-09R）ELISA 試劑盒（上海博蘊生物科技有限公司），一次性使用靜脈留置針（蘇州靈巖醫療器械有限公司），高速低溫離心機（安徽中科中佳科學儀器公司），光學顯微鏡（日本Olympus公司），超聲破膜儀（美國Sonics公司），Bio-Rad垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司），Las2000mini曝光機（美國General Electric公司），Multiskan Mk3型酶標儀（德國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組 采用隨機數字表法將大鼠分為正常對照組、癌癥模型組和熱創傷應激組3組，每組24只。

1.3.2 結直腸癌模型的建立 將MNU用無菌蒸餾水配制成濃度為4mg/ml的灌腸液對大鼠進行灌腸，灌腸前抓住大鼠尾巴促使大鼠將直腸內大便排出，用5ml注射器抽取灌腸液（1ml/200g）接上小兒灌腸管，導管前端用石蠟油涂抹，置入肛門約6cm，緩慢勻速推注，推畢后保持原位10min。灌注頻率：前4周以3次/周灌腸，4周后以1次/周持續灌腸至16周。每天對大鼠進行觀察，每次灌注前記錄1次體重。

1.3.3 熱創傷應激模型的建立 在結直腸癌模型基礎上，麻醉大鼠后，剪去大鼠背部脊柱兩側范圍約 30mm×30mm的長毛后，用8%硫化鈉脫毛，露出體表皮膚，將大鼠俯臥于手術固定板上，將特制的阻熱黃銅模板（12mm×12mm）放入100℃沸水中10min，取出后置于大鼠裸露皮膚處20s，將其重新加熱后置于脊柱另一側，整個燙傷過程只靠黃銅本身重力，不再另外施壓。

1.3.4 檢測標本采集 熱創傷應激組和癌癥模型組分別于熱創傷刺激后0、6、12和24h各隨機取6只大鼠取血和采集結直腸組織。正常對照組不作任何處理，根據另兩組處理時間各隨機取6只大鼠取血和采集結直腸組織。3組大鼠均于實驗結束時予5%水合氯醛7ml/kg腹腔內注射麻醉，尾靜脈穿刺取血；脫頸椎處死，取出肛緣至回盲部的結直腸組織，經液氮冰凍后-80℃保存。

1.4 血清指標檢測 采用ELISA法檢測大鼠血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質酮表達水平。

1.5 結直腸組織細胞周期蛋白（Cyclin）D1和髓樣細胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。取大鼠結直腸組織60mg，把組織剪切成細小的碎片，按照每20mg組織加入200μl裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑）。研磨后的勻漿在超聲破膜機下超聲破膜 10s×3次，4℃、12 000r離心 5min，小心吸取上清液，進行蛋白含量測定。在Bio-Tek熒光分析儀上測定并計算出實際濃度。灌膠上樣，采用Bio-Rad垂直電泳儀進行電泳，轉膜封閉過夜，洗膜后加入一抗孵育（稀釋度 1∶1 000）4℃搖床孵育過夜（16h），沖洗后加二抗孵育，曝光。采用Quantity One凝膠分析軟件行半定量分析，以Cyclin D1、Mcl-1與內參β-actin灰度值的比值反映Cyclin D1、Mcl-1的蛋白表達。

1.6 病理組織學觀察 部分結直腸組織于4%多聚甲醛固定24h，制備石蠟標本切片后行HE染色，觀察腫瘤組織病理形態，確定病理類型。

1.7 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況及病理檢查結果 臨床表現來看，正常對照組大鼠在實驗期間活動正常，體重增長，無死亡。癌癥模型組和熱創傷應激組大鼠實驗期間活動減少，精神萎靡，腹瀉，黏液膿血便，毛發脫落等，體重低于正常對照組，部分大鼠有腹水現象，也有死亡現象，解剖發現結腸腫瘤、腹腔有粘連。病理結果提示正常對照組大鼠結腸黏膜光滑，紋理清晰，未見充血、水腫（圖1a）。癌癥模型組和熱創傷應激組大鼠結直腸組織腺癌，癌組織多呈橢圓形、圓形，胞質豐富，核大畸形、深染，多見核分裂象，呈彌漫性生長。癌組織排列呈團狀或索狀，在腸壁中呈浸潤性生長，癌細胞間有結締組織（圖1b）。

圖1 大鼠病理所見（a：正常對照大鼠；b：結直腸癌大鼠；HE染色，×4）

2.2 各組大鼠血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質酮水平比較 癌癥模型組和正常對照組大鼠血清ACTH和皮質酮水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），但癌癥模型組大鼠血清IL-6、IL-10水平較正常對照組均升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。熱創傷應激組大鼠血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質酮水平較正常對照組和癌癥模型組均升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；且熱創傷應激組創傷應激后6、12、24h血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質酮水平較應激后0h均升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質酮水平比較

2.3 各組大鼠結直腸組織中Cyclin D1和Mcl-1蛋白表達水平比較 取正常對照組0h、癌癥模型組0h與熱創傷應激組0、6、12、24h 4個時間點的大鼠進行Cyclin D1和Mcl-1蛋白表達水平比較，發現熱創傷應激組4個時間點Cyclin D1和Mcl-1蛋白表達水平較正常對照組0h和癌癥模型組0h均升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；且熱創傷應激組創傷應激后6、12、24h Cyclin D1和Mcl-1蛋白表達水平較應激后0h均升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖2和表2。

圖2 正常對照組（N）0h、癌癥模型組（C）0h與熱創傷應激組（TIS）0、6、12、24h的 Cyclin D1和 Mcl-1蛋白表達電泳圖

表2 各組大鼠結直腸組織中Cyclin D1、Mcl-1蛋白表達水平比較（ng/ml）

3 討論

既往研究結直腸癌的腫瘤發生、腫瘤生物學和特定分子事件對結直腸生物學的影響，應用較多的是人類的結直腸癌活檢標本、結直腸癌異種移植物以及結直腸癌體外細胞培養模型，但這些方法使用的是已建立的腫瘤和結腸癌細胞系，具有突變復雜性，這限制了對單個突變影響的清晰理解[4]。另外這些模型大多應用于小鼠，會對實驗的操作及觀察空間有一定的限制，且不能完全自然模擬結直腸癌原位生長及侵襲轉移過程[5]。本實驗成功地通過MNU灌腸方法建立了大鼠結直腸癌模型，模擬大鼠結直腸癌自然誘導生長過程，成瘤時間相對較短，成瘤率高，腫瘤組織病理和生物學特性比較穩定，自然客觀地模擬了結腸癌的發生機制，應用SD大鼠又可進一步提升實驗操作的空間，為更深入地研究結腸癌發病機制、轉移機制和抗轉移治療提供了一種理想的動物模型。本實驗結果表明，癌癥模型組和熱創傷應激組大鼠與正常對照組相比實驗期間活動減少，精神萎靡，腹瀉、黏液膿血便、毛發脫落等，體重低于正常對照組，解剖發現結腸腫瘤、腹腔有粘連。大鼠腫瘤組織HE染色病理結果顯示癌細胞穿透結腸組織黏膜層、侵入肌層，提示結直腸癌模型制備成功。

理想的動物模型是手術應激研究的基礎，應該與圍術期產生的手術應激機制相近，模擬手術應激對機體造成的創傷；動物存活時間足夠長，不影響做后續的實驗研究；模型制作簡單，誘導因素單一，模型重復性好，造成手術應激的同時盡量避免觸發其他應激源對應激指標結果的干擾[6-7]。手術誘導的應激反應與熱創傷損害觸發的應激反應大部分類似[8]，熱創傷能夠提供一個創傷誘導的應激反應的模型，用來研究長時間應激反應的長期效應。目前，國內外建立的創傷應激動物模型種類繁多，以Regas FC和Ehrlich HP發明的銅梳燒傷模型應用較為廣泛[9]，且操作簡便可重復性好，被認為是研究創傷應激的合理方法，所以本實驗選擇該具有代表性的熱創傷應激模型，對結直腸癌大鼠造成熱創傷應激以進一步研究手術應激對腫瘤微環境的影響。

腫瘤的發生、發展過程復雜，其與機體的相互關系的研究也在不斷深入中，其中腫瘤微環境在腫瘤始動、進展、轉移和耐藥性中發揮著關鍵作用[10]。研究表明腫瘤多樣性和侵襲性都跟其微環境組成、生化特性、構造和生理特性相關[11]。手術切除腫瘤病灶除了能夠引起手術部位的局部改變，還可導致機體的全身性變化。手術創傷可通過應激激發引起全身炎癥反應、神經內分泌反應、細胞因子的變化、代謝改變以及其他一些可能的生物學反應，導致下丘腦、垂體、腎上腺軸興奮，皮質類固醇大量釋放，導致腫瘤微環境的變化，從而改變腫瘤的生物學特性[12-14]。本實驗用高溫黃銅塊對大鼠進行熱創傷處理，通過對比各組大鼠血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質酮水平來評估應激狀態，建立大鼠熱創傷應激模型。大鼠熱創傷即刻可見皮膚損傷，創傷1周內創傷處皮膚有水腫、出血、壞死。ELISA法測大鼠血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質酮水平表明熱創傷應激后上述指標水平顯著升高，提示熱創傷應激模型制備成功。

IL-6是腫瘤相關的重要促炎因子，其在結直腸癌及間質表型的結直腸癌細胞中高表達，在結直腸癌腫瘤炎性微環境中起著重要作用[15]。研究表明，經IL-6介導的信號通路在結直腸癌的發生、發展中發揮著重要的作用，IL-6可使信號轉導及轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3） 磷酸化[16]。磷酸化的STAT3（p-STAT3）進入細胞核，與特定的DNA序列結合，引起一系列促增殖蛋白（如 Cyclin D1）和抗凋亡蛋白（如 Mcl-1）的表達，從而導致腫瘤的發生。細胞的增殖狀態對研究腫瘤生物學行為、判斷其危害性具有及其重要意義，一旦細胞周期調控失常，就會導致腫瘤的惡性增生。Cyclin D1是細胞周期G期的關鍵調節因子，其功能受抑制可導致細胞周期停滯，而該蛋白的不規則表達則加速G1期[17]。Mcl-1蛋白屬B淋巴細胞瘤-2基因（bcl-2）家族蛋白，是一種高度調節蛋白，能夠引起廣泛的生存信號，也可作為細胞凋亡控制頂端的分子迅速下調凋亡過程，并通過早期介入導致線粒體細胞色素C釋放的級聯來促進細胞存活[18]。本研究檢測發現大鼠血清中IL-6在熱創傷應激后明顯升高，表明熱創傷應激可異常誘導IL-6水平。同時結直腸組織中兩個增殖凋亡相關蛋白在熱創傷應激后也能顯著升高，這說明熱創傷應激能夠促進結直腸癌大鼠腫瘤細胞增殖。

綜上所述，本實驗在成功構建的結直腸癌模型基礎上復合熱創傷應激，構建了結直腸癌大鼠熱創傷應激模型，具有操作簡便、重復性好等優點。熱創傷應激可引起大鼠血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質酮水平升高，導致手術應激相類似的激素改變。另外，熱創傷應激可導致結直腸癌大鼠體內IL-6的異常激活，誘導促細胞增殖蛋白（Cyclin D1）和抗細胞凋亡蛋白（Mcl-1）的表達，從而促進結直腸癌大鼠腫瘤增殖，故該模型可用于圍術期手術創傷對腫瘤微環境影響的機制研究，從而改善惡性腫瘤術后預后。