miR-125a在支氣管哮喘患兒血漿中的表達及其臨床意義

董善武， 陳 勇， 夏麗紅， 陳 玲， 何春枝

兒童支氣管哮喘是兒童最常見的慢性氣道疾病之一，其常見的臨床癥狀包括反復發作的喘息、胸悶、氣促和咳嗽等[1]。在中國，兒童支氣管哮喘患病率高達3.02%，且呈現出逐年上升的趨勢，給家庭和社會帶來沉重的負擔[2]。微小RNA(microRNA，miR)是一類只包含20余個核苷酸的單鏈非編碼RNA，廣泛存在于動植物及病毒中，并通過基因沉默等方式參與細胞生長、分化和凋亡等多種關鍵生命活動[3]。其中，miR-125a被發現可以調控包括中性粒細胞、巨噬細胞與調節性T細胞在內的多種免疫細胞活動及趨化因子和炎癥介質的表達，并參與慢性阻塞性肺病、系統性紅斑狼瘡與克羅恩病等炎癥性疾病的發生發展[4-10]。本研究旨在評估miR-125a在兒童支氣管哮喘中的表達及其與疾病患病風險、急性發作風險、嚴重程度與炎癥水平的關系。

1 對象與方法

1.1對象 連續納入2017年1月—2018年6月就診的急性發作期支氣管哮喘患兒70例、緩解期支氣管哮喘患兒70例。急性發作期支氣管哮喘患兒納入標準：(1)符合兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)中急性發作期支氣管哮喘診斷標準；(2)年齡<16周歲。排除標準：(1)除呼吸道或肺部感染以外合并其他嚴重感染者；(2)合并惡性血液疾病或腫瘤者。緩解期支氣管哮喘患兒入組標準：(1)符合兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)中支氣管哮喘診斷標準；(2)經過治療或未經治療癥狀、體征消失，肺功能恢復到急性發作前水平，并維持3月以上；(3)年齡<16周歲。排除標準與急性發作期支氣管哮喘患兒一致。同時，研究納入70例于醫院健康體檢中心進行健康體檢的兒童作為健康對照，入組標準：(1)年齡、性別、身高、體質量與入組支氣管哮喘患兒相匹配；(2)無哮喘病史以及過敏性疾病史；(3)1月內未使用過免疫抑制劑或皮質激素類藥物；(4)無感染、炎癥性疾病、血液系統疾病或惡性腫瘤。入組急性發作期支氣管哮喘患兒男性36例，女性34例，年齡(6.4±2.7)歲(2～14歲)，身高(116.2±16.8)cm(86～159 cm)，體質量(22.9±7.8)kg(11.2～45.2 kg)，有家族哮喘病史者20例(28.6%)；緩解期支氣管哮喘患兒男性38例，女性32例，年齡(6.6±2.4)歲(3～14歲)，身高(117.3±15.7)cm(92～164 cm)，體質量(23.2±7.3)kg(13.2～53.8 kg)，有家族哮喘病史者16例(22.9%)；健康兒童男性42例，女性28例，年齡(7.4±2.6)歲(3～15歲)，身高(116.7±16.5)cm(92～166 cm)，體質量(23.4±7.9)kg(13.1～51.4 kg)，有家族哮喘病史者9例(12.9%)。3組受試者的年齡、性別、身高、體質量以及有家族哮喘病史者比例比較，差別均無統計學意義(P>0.05)。本研究已獲得倫理審查委員會批準，入組前所有受試者法定監護人均已簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1資料收集 記錄入組急性發作期支氣管哮喘和緩解期支氣管哮喘患兒的年齡、性別、身高、體質量、家族哮喘病史等基本信息，并收集其入院時實驗室檢測結果和肺通氣功能檢測結果，包括嗜酸性粒細胞水平、免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)水平、第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in 1 second，FEV1)與用力肺活量(forced vital capacity，FVC)之比(FEV1/FVC)、FEV1實測/預測值百分比。同時，對于急性發作期支氣管哮喘患兒，入院時的哮喘急性發作嚴重程度依據兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)進行評估并記錄。對于入組的健康兒童在獲得其法定監護人的書面知情同意后，收集其年齡、性別、身高、體質量、家族哮喘病史等基本信息，記錄肺通氣功能檢測結果，并采集血液樣本用以檢測嗜酸性粒細胞水平、IgE水平及后續研究。

1.2.2血液樣本采集和處理 采用抗凝管采集全血，1 h內離心分離血漿：離心機預冷至4 ℃，1 600 g離心10 min，吸取上清液，再次以4 ℃，16 000 g離心10 min。將血漿轉移至凍存管中，置于-80 ℃保存，待后續檢測。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)檢測受試者血漿miR-125a相對表達量，并用酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent sorbent assay，ELISA)試劑盒(美國Abcam公司)檢測受試者血漿中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin-1β，lL-1β)、IL-6和IL-17的水平。

1.2.3qPCR檢測 采用TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)從患兒及健康兒童血漿樣本中提取總RNA，并使用逆轉錄試劑盒(德國Qiagen公司)將RNA逆轉錄為cDNA。取逆轉錄產物為模板，使用miR-125a特異性引物進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)。并以U6作為miR-125a內參，采用2-△△Ct方法計算miR-125a 相對表達水平。引物序列如下：

miR-125a：

正向：5′-ACACTCCAGCTGGGTCCCTGAGACCCTTTAAC-3′

反向：5′-TGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′U6：

正向：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′

反向：5′-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3′

2 結 果

2.1miR-125a在3組受試者中的表達及其對3組受試者的區分作用 miR-125a在急性發作期支氣管哮喘患兒中的表達水平[0.374(0.266～0.613)]顯著低于緩解期支氣管哮喘患兒[0.745(0.566～0.977)](P<0.001)和健康兒童[1.024(0.547～2.350)](P<0.001)，在緩解期支氣管哮喘患兒中的表達水平亦顯著低于健康兒童(P=0.022)(圖1A)。ROC曲線表明，miR-125a可以分別區分急性發作期和緩解期支氣管哮喘患兒(AUC：0.788，95%CI：0.710～0.866，圖1B)、急性發作期支氣管患兒和健康兒童(AUC：0.817，95%CI：0.749～0.885，圖1C)以及緩解期支氣管哮喘患兒和健康兒童(AUC：0.613，95%CI：0.516～0.709，圖1D)。同時，miR-125a區分急性發作期和緩解期支氣管哮喘患兒在最佳切割點(miR-125a表達量：0.496)的敏感性為67.1%，特異性為85.7%；miR-125a區分急性發作期支氣管哮喘患兒和健康兒童在最佳切割點(miR-125a表達量：0.809)的敏感性為87.1%，特異性為61.4%；miR-125a區分緩解期支氣管哮喘患兒和健康兒童在最佳切割點(miR-125a表達量：1.040)的敏感性為85.7%，特異性為50.0%。最佳切割點定義為敏感性和特異性之和達到最大時miR-125a的表達水平。

圖1 miR-125a相對表達量在3組受試者中的差異Fig 1 miR-125a expressions and ROC curves

2.2急性發作期支氣管哮喘患兒miR-125a表達水平與疾病嚴重程度的關聯 miR-125a在輕度、中度和重度急性發作期支氣管哮喘患兒中表達水平分別為0.705(0.547～1.453)、0.374(0.293～0.484)和0.199(0.102～0.278)，進一步分析發現，miR-125a的表達水平與急性發作嚴重程度呈顯著負相關(P<0.001)。

2.3miR-125a表達水平與嗜酸性粒細胞、IgE、FEV1/FVC及FEV1實測/預測值百分比的關聯 在急性發作期支氣管哮喘患兒中，miR-125a表達水平與FEV1/FVC(P<0.001，r=0.502)及FEV1實測/預測值百分比(P<0.001，r=0.510)呈顯著正相關，與嗜酸性粒細胞(P=0.181，r=-0.162)和IgE(P=0.535，r=-0.075)無關；在緩解期支氣管哮喘患兒和健康兒童中，miR-125a表達水平與嗜酸性粒細胞、IgE、FEV1/FVC和FEV1實測/預測值百分比無關(P>0.05,表1)。

2.4miR-125a表達水平與炎癥因子的關聯 在急性發作期支氣管哮喘患兒中，miR-125a表達水平與TNF-α(P=0.005，r=-0.331)，IL-1β(P=0.007，r=-0.318)及IL-17(P=0.037，r=-0.250)水平呈顯著負相關；在緩解期支氣管哮喘患兒中，miR-125a表達水平與TNF-α(P=0.032，r=-0.256)及IL-17(P=0.001，r=-0.376)水平也呈顯著負相關；在健康兒童中，miR-125a表達水平與IL-6(P=0.024，r=-0.269)及IL-17(P=0.026，r=-0.266)水平亦呈顯著負相關(表2)。

表1miR-125a相對表達量與嗜酸性粒細胞、IgE、FEV1/FVC及FEV1實測/預測值百分比的關聯
Tab 1Association of miR-125a expression with eosinophil, IgE, FEV1/FVC and FEV1(actual)/FEV1(predicted) levels

項 目miR-125a相對表達量P值相關系數(r)急性發作期支氣管哮喘患兒 嗜酸性粒細胞0.181-0.162 IgE0.535-0.075 FEV1/FVC<00010.502 FEV1實測/預測值百分比<00010.510緩解期支氣管哮喘患兒 嗜酸性粒細胞0.233-0.145 IgE0.052-0.233 FEV1/FVC0.286-0.129 FEV1實測/預測值百分比0.698-0.047健康兒童 嗜酸性粒細胞0.0790.211 IgE0.5430.074 FEV1/FVC0.061-0.225 FEV1實測/預測值百分比0.878-0.019

IgE：免疫球蛋白E；FEV1：第1秒用力呼氣容積；FVC：用力肺活量.

表2miR-125a相對表達量與炎癥因子的關聯
Tab 2Association of miR-125a expression with inflammatory factors

項 目miR-125a相對表達量P值相關系數r急性發作期支氣管哮喘患兒 TNF-α0.005-0.331 IL-1β0.007-0.318 IL-60.089-0.205 IL-170.037-0.250緩解期支氣管哮喘患兒 TNF-α0.032-0.256 IL-1β0.098-0.200 IL-60.061-0.225 IL-170.001-0.376健康兒童 TNF-α0.081-0.210 IL-1β0.077-0.213 IL-60.024-0.269 IL-170.026-0.266

TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細胞介素.

3 討 論

本研究發現：(1)miR-125a在急性發作期支氣管哮喘患兒中的表達水平顯著低于緩解期支氣管哮喘患兒與健康兒童，在緩解期支氣管哮喘患兒中的表達水平亦顯著低于健康兒童，ROC曲線提示miR-125a可以顯著區分3組受試者。(2)miR-125a表達水平與急性發作期支氣管患兒的疾病嚴重程度呈顯著負相關，而與肺通氣功能呈顯著正相關。同時，miR-125a還與3組受試者炎癥因子水平呈顯著負相關。

miR作為一類重要的非編碼RNA，其在各種疾病發病中的作用受到越來越多的關注和研究[11-12]。近幾年來，有大量文獻報道miR-125a廣泛參與炎癥活動[10,13-15]。Qin等發現，miR-125a可以通過調控粒細胞生長調節因子Socs3從而影響中性粒細胞的分化和浸潤[16]。Pan等發現，miR-125a基因敲除的小鼠容易出現結腸炎和實驗性自身免疫性腦脊髓炎，且注射正常調節性T細胞后可以改善這些小鼠的癥狀，而注射miR-125a基因敲除的調節性T細胞后小鼠癥狀無明顯改善，提示miR-125a通過調控調節性T細胞的活動從而抑制異常炎癥活動[17]。Zhao等發現，miR-125a表達水平在系統性紅斑狼瘡患者CD4+T細胞中顯著低于健康對照者，且其可以下調趨化因子CCL5的表達，而后者可以募集淋巴細胞并激活自然殺傷細胞，表明miR-125a通過調控CCL5從而抑制系統性紅斑狼瘡患者體內異常的炎癥活動[15,18]。同時，miR-125a在系統性紅斑狼瘡有肺部累及患者中的表達水平亦顯著低于無肺部累及的患者，且其還可以抑制IL-16介導的中性粒細胞的募集，提示miR-125a通過抑制中性粒細胞活動從而緩解系統性紅斑狼瘡患者體內肺部炎癥損傷[14]。在另一個研究中，Sun等發現，miR-125a在活動的克羅恩病患者中的表達水平顯著低于非活動的克羅恩病患者及健康對照者，且其可以分別區分活動與非活動的克羅恩病患者及活動的克羅恩病患者和健康對照者。同時，miR-125a在活動的克羅恩病患者中的表達水平與急性期反應蛋白、紅細胞沉降率、疾病活動指數、IL-17和TNF-α呈顯著負相關[8]。以上研究表明，miR-125a通過調控多種炎癥活動從而參與炎癥性疾病的發生發展。

鑒于兒童支氣管哮喘也是一種慢性炎癥性疾病，并且在其發病過程中有包括嗜酸性粒細胞、T細胞、巨噬細胞和中性粒細胞在內的多種炎癥免疫細胞以及白介素、趨化因子和組胺等炎癥介質參與，筆者推測，miR-125a與兒童支氣管哮喘的患病和急性發作也密切相關[19]。本研究中，筆者發現miR-125a在急性發作期支氣管哮喘患兒中的表達水平顯著低于緩解期支氣管哮喘患兒與健康兒童，在緩解期支氣管哮喘患兒中的表達水平亦顯著低于健康兒童，ROC曲線表明miR-125a可以顯著區分這3組受試者，提示miR-125a對兒童支氣管哮喘患病及急性發作具有預測價值。這與文獻報道的miR-125a在系統性紅斑狼瘡及克羅恩病中顯著低表達的結果一致[8,18]。同時，筆者還發現，miR-125a表達水平與急性發作期支氣管患兒的疾病嚴重程度及所有3組受試者炎癥因子水平呈顯著負相關而與患兒肺通氣功能呈顯著正相關，表明miR-125a對兒童支氣管哮喘疾病嚴重程度與炎癥水平具有預測作用。可能的原因為miR-125a通過多種通路調控某些炎癥免疫細胞(如調節性T細胞、IFN-γ+T細胞、IL-17+T細胞和中性粒細胞)的活動并下調炎癥因子(如TNF-α、IL-6和IL-17等)的表達，緩解這些炎癥因子帶來的炎癥損傷從而抑制兒童支氣管哮喘患病及發作，而下調miR-125a表達水平則促進支氣管哮喘的患病和急性發作，加重炎癥活動，進而加重患兒疾病嚴重程度和炎癥損傷。

本研究揭示了miR-125a在支氣管哮喘患兒中的表達及其與兒童支氣管哮喘患病、急性發作、嚴重程度與炎癥水平的關系，對進一步探索miR-125a在兒童支氣管哮喘和其他炎癥性疾病中的作用及分子生物學機制奠定了基礎。在本研究中，考慮到miR-125a在支氣管黏膜中的表達水平不容易測定，因此測定的是miR-125a在血漿中的表達水平，而miR-125a在血漿中的水平可能受到多種因素影響，容易引入混雜偏倚。同時，該研究為中等樣本量的單中心研究，因此需要后續更大樣本的多中心研究進行驗證。