尿外泌體與腎臟疾病相關性最新研究進展

吳志佳 張 瑞

南京醫科大學康達學院，江蘇省連云港市 222000

我國是尿毒癥的高發國家，當腎臟疾病發展至終末期階段，必定導致尿毒癥。引起尿毒癥的原因主要包括：原發性的或繼發性的慢性腎小球腎炎走向慢性腎衰竭，糖尿病腎病以及膜性增生性腎病等也是引起尿毒癥的原因之一。目前有遺傳性的多囊腎也逐漸成為我國腎病高死亡率的原因之一。當腎臟發生病理上的壞死缺血及生理上的功能損傷是最先由尿液的性狀特征、氣味、顏色等方面表現出來。尿外泌體是一種細胞外囊泡，來源于腎臟和泌尿道的各種細胞釋放的。當腎臟功能受損，及其腎小球、腎小管等結構的損傷，都會排泄相應的受損廢物——囊泡狀物質，所以外泌體是直接反應腎臟生理功能的最佳指標。通過尿液中尿外泌體成分的分析，通過定量指標檢測，可以精確地確定腎臟受損的嚴重程度及其生理功能的狀態，從而可以避免臨床上侵入性診斷腎臟疾病。

1 尿外泌體

1.1 概述 外泌體是一種形似于含有大量的活性物質的囊泡狀顆粒物，并且通過信號轉導在細胞間傳遞遺傳物質。20世紀80年代，通過在體外培養的綿羊紅細胞培養液中， R.M.Johnstone[1]和Eberhard G.Trams這兩位科學家初次發現了外泌體[2]。到2007年，Valadi發現并證實了外泌體中包含的mRNA以及microRNA具備良好的生物活性開發其研究價值。通過相關的研究實驗，外泌體可以在人體的排泄物以及體內流動的血液和組織液中提取并分離出來。尿外泌體是由腎及泌尿道的相關器官中各種細胞合成并釋放到尿液中的胞外囊泡，因此尿外泌體中含有的氨基酸及核酸物質可以作為衡量來源細胞生理狀態的最佳指標。

1.2 尿外泌體的來源 除血液之外，尿液是另一種潛在的液體活檢樣本的來源。與血樣相比，尿液的侵入性更小，安全性更高，易于操作得以保存。尿外泌體是來自腎臟或其他泌尿系統細胞分泌的包含蛋白質及核酸等物質的細胞外囊泡(EVs)，腎小管、腎小球、膀胱細胞及前列腺的尿外泌體中所包含的蛋白質及核酸物質，可作為腎臟疾病的生物學標志物，現階段，研究人員通過分析蛋白質等組學成分，事實證明，幾乎所有腎臟的先天細胞都能分泌外泌體，小鼠腎細胞的足細胞在電鏡下可以看到多囊體和外泌體的存在[3]。隨著研究視角的轉變，小鼠的生殖道器官在電鏡下也能觀察到尿外泌體。有些尿外泌體是隨著血液循環，最后流入腎臟，通過相關的腎小球濾過功能排泄到體外，也可以成為尿外泌體，但所占比例微乎其微。

1.3 尿外泌體的提取分離 曾有研究利用兩步超速離心法，這是第一次從尿液中對尿外泌體進行了成功的分離提取，隨著科學研究技術以及不斷發展成熟的技術手段，近年來可通過超速離心法、超濾法、磁珠免疫法等分離尿外泌體，這些方法各有利弊，若想要同時確保分離所得的尿外泌體的純度、產量及其生物活性的話到目前為止有一定難度，這也是實驗后期我們亟須考慮解決的問題，使之盡可能達到最優化。至今，人們對如何收集純化尿外泌體并無統一標準，超速離心法的使用較其他方法多一些，主要根據差速離心的原理進行操作，該法操作簡單，依次清除體內的細胞，將殘余的碎片清理干凈，最后沉淀尿外泌體以到達收集純化的效果，由于處理起來產量不足相對耗時等缺點，需定制一個既省時產量又多的提取方法，在其純度及生物學活性上也需密切關注。

2 尿外泌體作為生物標志物的應用方面

大量研究表明，尿外泌體中的大量生物標記物與腎臟疾病相關，為了在大量人群中廣泛篩查疾病，通過檢驗入院患者尿液中的蛋白質及核酸成分，據其成分組成推斷來源器官的生理狀態是否良好，判斷來源器官的結構是否完整以及功能是否受到損傷破壞，目前已有大量新型生物標記物可以標記推斷出相關腎臟疾病。

2.1 急性腎損傷 急性腎損傷(Acute kidney injury，AKI)是臨床上常見的急性危重病，腎功能突然發生的(1～7d內)或持續(24h以上)下降，具有高死亡率特征的一種危重疾病[4]。臨床病診斷標準為血清肌酐(Scr)升高的含量至少達到0.5mg/d，出現氮質血癥、水電解質紊亂、酸堿平衡失調和一些其他的全身疾病癥狀。可伴有少尿(<400ml/24h或17ml/h)或無尿(<100ml/24h)，只有當腎小球濾過率降低 50% 以上時，血清肌酐濃度才有明顯的上升現象，故臨床上迫切需要能夠提示早期腎功能下降的指標。AKI動物模型研究顯示，在早期(6～48h)水通道蛋白-1與鈉氫離子交換體[5]發生顯著的下降，相較于傳統的鈉排泄指標分數而言，尿視黃醇結合蛋白有高度的敏感性和高特異性等優勢。此外，在損傷早期(2～6h)，尿外泌體的胎球蛋白-A、轉錄活化因子[6]和足細胞的骨架巢蛋白表達程度較高，較常規操作的血肌酐酶，可提前(18～48h)發生顯著的改變。

2.2 腎小管疾病 腎小管疾病(Renal tubular disorders)是指一組以腎小管功能障礙為主要特征的腎臟病變。該疾病的主要臨床表現包括腎性糖尿病、低分子量蛋白尿、氨基酸尿或電解質紊亂及酸中毒，多種水轉運蛋白和離子轉運蛋白在尿外泌體中被發現，側面可以反映出腎小管的生物轉運活性的臨床豐度，因此這些轉運蛋白可作為評價腎小管功能的生物標志物。

2.3 多囊腎病 多囊腎病在臨床上屬于嚴重的遺傳性腎臟疾病，多囊腎是由腎小管的變形擴張演變而來，又名Potter(Ⅰ)綜合征。1941年，我國朱憲彝首次報道多囊腎病，多囊腎有兩種類型，一種為常染色體顯性遺傳型，因其常在青中年時期發病，故又稱為成年型。另一種與之相反，常染色體隱性遺傳又稱嬰兒型，表現為雙腎腫大，在小兒上由于缺乏表達及相關癥狀，所以在臨床上很難被診斷出來，發病率為1∶1 000[7]，其發病機制與人體纖毛的發育異常密切相關。腎臟纖毛表達的多囊蛋白-1和多囊蛋白-2等其他囊蛋白共同參與形成囊蛋白復合體，腎小管受壓后使得腔內水壓上升，促進體內鈣離子內流增加，將機械能刺激轉變成化學信號，對生理性的左右不對稱發育有引導作用。通過對尿外泌體的蛋白組獨臂分析，在多囊腎病中可以檢測到4種蛋白組的物質。最具有評估多囊腎病的預后價值的要數多囊蛋白與跨膜蛋白的相關性。因其具有遺傳相關性，在懷孕期間通過檢測PKD1或PKD2基因可有效降低新生兒缺陷率[8]。

2.4 腎小球疾病 腎小球足突細胞損傷狀態時，腎母細胞瘤蛋白-1(Wilms tumor 1 protein，WT1)是腎臟發育的重要轉錄因子，尿外泌體是WT1內載有的生物標志物。WT1在局灶節段性腎小球硬化的動物模型中腎穿標本中表達有所上升，并早于蛋白尿出現[9]。Zhou 等在 FSGS 和塌陷性腎小球病兩種動物模型中發現尿外泌體的 WT1 早于蛋白尿升高，且升高幅度更明顯[10]，并可用來評估 ARB 類藥物的治療效果[11]。此外，尿外泌體 WT1 與早期 DN 患者的尿蛋白/血肌酐水平呈明顯相關[12]，可作為 DN 早期腎功能的監測標志。另有研究通過定量分析患者尿外泌體中與腎臟的足細胞生理相關的基因從而達到區分微小病變和局灶節段性腎小球硬化的目的[13]。對Ⅰ型糖尿病合并早期DN 患者尿外泌體的 miRNA 進行表達差異分析，發現miR145 與對照組相比有顯著的升高。為進一步提高檢測的陽性率，通過高濃度碳水化合物刺激腎小球系膜細胞后，細胞中的 miR145 升高更加顯著，暗示了miR145 可能成為1型糖尿病患者新的生物標記物，成為臨床診斷的判斷依據。

3 尿外泌體在相關腎臟疾病中的臨床治療

外泌體，一種普遍存在人體血液、尿液中的囊泡物質，不僅可以作為腎臟疾病診斷的相關性指標，同時外泌體也不斷被挖掘在腎臟疾病治療中的未來臨床潛力。外泌體具有免疫作用、靶向運輸作用以及保護修復三大作用[14]。

3.1 通過免疫作用的治療應用 依據其免疫作用，在臨床上已經得到較多的應用。分泌腫瘤細胞的外泌體可以促進腫瘤的生長與浸潤，抑制腫瘤的特異性免疫以及免疫監視作用，但經研究發現，腫瘤外泌體包含了一種抗原，此抗原可抑制癌基因生長，促進主要組織相容性復合體的一類分子細胞增殖分化[15]，并促使T細胞依賴的同種異型腫瘤進行免疫防御。骨髓抑制細胞可以抑制T淋巴細胞的增殖與活化，在癌癥的發展進程中，臨床可應用MDSC對癌細胞進行標記抑制腫瘤細胞生長擴散，在Stat3磷酸化與其外泌體的Hsp70的共同作用下，MDSC外泌體中所包含抗原可以發揮抑制腫瘤生長的免疫作用[16]。在臨床診治中具有特異性，且靶向目標明確，將其應用于腎細胞癌相關的治療中，無疑是一項新的治療技術上的進步。

3.2 通過靶向運輸作用的治療應用 靶向運輸作用需要一個通常穩定的內環境，內皮組織可維持血流通暢，血壓穩定，不易發生凝血阻塞，利于血脂清除，因而成為外泌體主要靶點的首選。研究證明上皮組織釋放一種叫促轉錄因子3(ATP3)的外泌體，在腎缺血再灌注損傷時可發揮巨大作用，該外泌體可抑制上皮細胞MCP-1的表達，抑制單核細胞促進蛋白-1的釋放，抑制巨噬細胞向外周擴散破壞組織結構，從而腎缺血再灌時就不易發生大面積損傷甚至壞死，該種外泌體可針對腎缺血再灌注所造成的損傷進行有效保護及治療[17]。

3.3 通過保護修復作用的治療應用 外泌體作為間充質干細胞條件培養基的活性成分物質，其保護修復作用在臨床應用中意義非凡，可保護腎缺血再灌注造成的損傷現象并對其進行修復作用，縮短腎臟功能的恢復時間，當組織發生炎癥反應時，含轉錄激活因子3 的RNA外泌體可減弱炎癥反應對機體造成的損傷，從而保護腎臟[18]。例如，在急性腎臟損傷時，外泌體通過旁分泌的作用，一方面減少腎臟的損傷程度，一方面也能提高腎臟缺損的修復速度。

目前運用到臨床診斷腎病的主要依靠微蛋白、肌酐以及腎小球濾過率等測定。然而能夠精確的診斷某一種腎病類型以及損傷程度只能依靠侵入性的穿刺做病理活檢。尿外泌體在腎臟疾病方面有著得天獨厚的優勢。作為腎臟疾病發展的第一診斷指標，發現特異性的尿外泌體，通過對其篩查，必定可以作為疾病早期診斷的指標。目前，越來越多的實驗研究證實了泌尿系統中尿外泌體的作用，對相關疾病的治療將會成為新時期的一個研究熱點。