PCSK9抑制劑與低密度脂蛋白水平的研究進展

羅群華 黎明江 王 鑫

血漿低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平升高是冠心病的危險因素，積極降低LDL-C能顯著減少冠心病的致殘率和致死率[1]。大量的臨床試驗證明，降低LDL-C沒有下限，對于高風險患者更低的LDL-C水平可能更有益[2]。他汀類藥物是目前降低LDL-C水平的重要藥物，但他汀類藥物即使在初始劑量基礎上藥物劑量翻倍，降脂獲益僅增加6%，被認為是“他汀的瓶頸”[3]。而且，目前最大耐受的他汀類藥物治療劑量可能不足以充分降低LDL-C水平[4]。前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/ kexin 9型(PCSK9)抑制劑是降脂藥的新起之秀，能顯著降低LDL-C，并且在家族性高膽固醇血癥(familial hypercholesterolemia，FH)、他汀類藥物不耐受的患者或已經服用最大劑量他汀類藥物但仍需要脂質減少的患者中可能特別有益。在不同的高風險患者組中，針對PCSK9的人單克隆抗體可以將LDL-C水平降低55%～72%[5]。而且，最近已報道PCSK9單克隆抗體在大規模臨床試驗中可顯著降低心血管事件發生率。本文將對PCSK9分子結構及其作用機制、PCSK9抑制劑的分類及相關臨床研究進展進行綜述，評價PCSK9抑制劑對降低LDL-C水平的有效性及應用的安全性。

一、PCSK9的分子結構

PCSK9是一種肝酶，是由692個氨基酸殘基組成的糖蛋白，在分泌型絲氨酸蛋白酶家族中是第9個被發現的前蛋白轉化酶，是繼LDL受體基因和載脂蛋白B基因后，發現的第3個可致常染色體顯性高膽固醇血癥的第3個基因。它主要存在于肝臟，可以調節LDL-R并因此調節LDL-C水平[6]。PCSK9的人22kb基因位于染色體1p32的小臂上，含有12個外顯子和11個內含子，其表達和合成受甾醇調節元件結合蛋白2和肝X受體調節[7]。PCSK9最初合成為稱為pro-PCSK9的75kDa可溶性酶原，其含有N-末端信號肽、前結構域、催化結構域和富含半胱氨酸-組氨酸的C-末端結構域。pro-PCSK9在內質網中的自催化裂解，釋放出信號肽、前結構域和60kDa成熟蛋白，緊接著前結構域與成熟蛋白質結合，促進其轉到高爾基體并形成成熟的PCSK9，然后在細胞內直接起作用或是被分泌進入循環。

二、PCSK9的作用機制

正常過程中，LDLR通過載脂蛋白B(apoB)結合LDL-C，將其內吞入肝細胞內并靶向溶酶體，引導其進行降解，而且LDL-R可以反復循環引入數百個LDL顆粒進入細胞。而PCSK9通過結合LDL-R抑制了該循環，使得LDL-C難以進入肝細胞進行降解，從而發揮其調節LDL-C的作用。當細胞內膽固醇降低時，PCSK9轉錄表達，抑制LDL-R的活性[5]。

1.PCSK9在肝細胞內外參與LDL-C代謝:PCSK9可以在肝細胞內外直接與LDL-R受體結合從而阻止循環，也可分泌入血后先與LDL-C顆粒結合然后再在肝細胞外作用于LDL-R受體。當細胞內膽固醇水平降低時，PCSK9開始轉錄表達。PCSK9可以與LDL-R的表皮生長因子前體同源結構域A結構域結合，并與受體一起內化[8]。在內體中存在的酸性條件下，LDL-R和PCSK9之間的親和力增加。PCSK9的結合導致LDL-R的構象變化，這阻止了LDL-R的正常再循環。但是，盡管PCSK9進入細胞依賴于LDL-R，但大部分內化的PCSK9在細胞內會滯留數小時[5]。這個時間滯后表明包含有PCSK9和LDL-R的內含體不會導致配體和受體立即靶向溶酶體，并且可能存在允許單個PCSK9分子返回表面并作用于新LDL-R的循環回路。這種相互作用模式(LDL-R導向溶酶體時配體再循環)不同于與含apoB的脂蛋白(LDL-R再循環時配體導向溶酶體)的典型相互作用。

2.PCSK9在血液中參與LDL-C代謝:當PCSK9被分泌入血后，其中的一半可以與LDL顆粒或脂蛋白α顆粒結合，另一半有的成為高密度脂蛋白(HDL)的一部分，有的游離于血漿中。有趣的是，與LDL結合的PCSK9大多數處于完整形式，而自由循環的PCSK9主要是作為弗林蛋白酶切割的較短蛋白質，對LDL-R的親和力可能降低[9]。而血漿中LDL顆粒濃度較PCSK9高出很多，平均每500個天然LDL顆粒可以與1個PCSK9蛋白相配對。那么，很容易推測出，存在這樣一種細胞外隨機過程，細胞外結合有PCSK9的LDL-C顆粒在進入肝細胞時，PCSK9與LDL-R結合，介導LDL-C及LDL-R一起靶向溶酶體，但是結合有PCSK9的LDL-C顆粒幾乎500個里面只有1個。不難想像，肝臟就是這么調節LDL并最終控制全身膽固醇體內平衡。這也為單個LDL-R分子在失活前能夠循環數百次提供了合理的解釋[10]。這個過程依賴于復雜和精細的細胞調節機制，如甾醇反應元件結合蛋白(SREBP)和肝X受體轉錄途徑。

3.PCSK9在動脈斑塊中參與LDL-C代謝:PCSK9可自由循環通過動脈斑塊中的細胞外空間，此外，斑塊巨噬細胞和平滑肌細胞可以分泌PCSK9并可以受其作用。這意味著在正常情況下，動脈粥樣硬化細胞中的LDL-R表達受PCSK9局部濃度的調節[11]。與肝臟不同的是，斑塊在有效攝取脂蛋白膽固醇后，可能誘導斑塊局部進展或不穩定。可以設想，治療性PCSK9抑制可以在斑塊細胞中產生LDL-R的上調，從而導致粥樣斑塊中膽固醇積累的增加。

PCSK9對動脈粥樣硬化的影響包括對LDL代謝的全局影響，對動脈粥樣硬化病變內LDL代謝的局部影響，以及對其他致動脈粥樣硬化機制如炎癥的影響。動脈粥樣硬化是動脈壁的慢性炎性疾病，其特征在于內皮細胞活化、單核細胞和血管平滑肌細胞的積聚。動脈粥樣硬化病變是位點特異性的，并且在低切應力區域優先發展。低切應力增加人和小鼠內皮細胞和平滑肌細胞PCSK9的表達，PCSK9表達與單核細胞趨化性和低切應力區黏附之間的關聯表明PCSK9與炎癥之間呈相關性[12]。PCSK9這種在血管壁中的直接促炎作用，可能通過作用于LDL-R相關蛋白1(LRP1)，對斑塊巨噬細胞的炎癥方面發揮強烈的調節作用。有研究表明，LRP1的缺失可以誘導炎癥，而斑塊中的PCSK9可以降低LRP1水平[13]。那么斑塊中的高濃度PCSK9有促炎作用，這與其在斑塊中下調LDL-R、降低LDL-C的作用恰恰相反。因此，通過單克隆抗體對PCSK9的治療性阻斷可能具有正面和負面效應的組合，盡管其對血漿LDL-C減少有巨大效益，但在臨床研究中到底獲益如何還需進一步評估。

三、PCSK9抑制劑

PCSK9抑制劑通過阻斷PCSK9對LDL-R的降解，降低循環LDL-C水平。根據其作用機制不同，可分為3類：①單克隆抗體或模擬抗體蛋白物：直接抑制PCSK9蛋白與LDL-R結合;②反義寡核苷酸或小干擾RNA(siRNA)：通過基因沉默作用來抑制 PCSK9 轉錄合成;③作用于PCSK9蛋白催化部位的低分子肽類：這些肽類可與PCSK9蛋白的催化部位結合使其發生變構，進而影響到 PCSK9 蛋白與LDL-R結合。

1.PCSK9抑制劑-單克隆抗體:在針對PCSK9開發的幾種單克隆抗體中，evolocumab和alirocumab這兩種已被批準用于臨床。兩者都是皮下使用的全人單克隆抗體。

(1)evolocumab：evolocumab的給藥劑量以每2周140mg或每月420mg。這兩種劑量均可以使血漿LDL-C水平產生相似程度的降低[14]。在Ⅲ期臨床試驗中，無論是作為單藥治療，還是加入他汀類藥物治療，還是對他汀類藥物不耐受或給予雜合子FH的患者，該劑量的evolocumab均可使血漿LDL-C水平降低約60%[15]。總體而言，血漿LDL-C水平的降低在不同的臨床亞組中高度一致。此外，無論基線血漿PCSK9水平如何，evolocumab均可降低LDL-C水平。

(2)alirocumab:多種alirocumab給藥方案已用于Ⅲ期臨床試驗。一種方案是基于血漿LDL-C水平降低程度的效價劑量：患者從每2周75mg alirocumab開始，然后如果LDL-C水平≥70mg/dl，則劑量將增加至每2周150mg。一般來說，這種方法可使LDL-C水平降低45%～50%，無論是單藥治療，還是加用他汀類藥物治療或對于他汀類藥物不耐受的患者[16]。在這些試驗中，alirocumab的最大劑量，每2周150mg，血漿LDL-C水平降低約60%，這與evolocumab所示的相似。在另一項試驗中，每4周300mg的alirocumab方案將血漿LDL-C水平降低55%～60%。數據顯示，在雜合子FH患者中，alirocumab治療使LDL-C水平降低約40%～60%。在純合子FH患者中，根據患者的基因型，用alirocumab治療觀察到的LDL-C水平下降范圍為7%～64%不等[17]。

(3)單克隆抗體可升高循環中PCSK9水平:針對PCSK9的兩種目前可用的抗體，其在循環中與PCSK9以約1∶1的化學計量比結合并禁止其與LDLR結合，從而產生導致LDL-R大量積累且PCSK9缺陷的狀態。在肝細胞膜上，LDL顆粒加速清除，血漿LDL-C水平大幅下降。皮下注射75～150mg的alirocumab或140～420mg的evolocumab引入了大量過量(相對于目標超過100∶1)的抗體，在給藥的短短幾個小時內捕獲所有循環的PCSK9并將在接下來的幾天捕獲所有新分泌的PCSK9[18]。報告治療患者中幾乎沒有游離PCSK9的數據，也就未能全面反映注射抗體后循環中PCSK9的情況，因為這種抑制PCSK9的方法實際上導致血液中靶標的大量積累。使用靶向單克隆抗體的患者PCSK9的總血漿濃度平均增加10倍，而在某些個體中甚至增加20倍[19]。這種極端積累有不同的解釋：①因為PCSK9不再能夠獲得更有效的LDL-R途徑，PCSK9的清除速度之前減慢許多；②注射后幾天新產生的PCSK9將被捕獲，并與治療性抗體混合在循環中；③也有可能是肝臟對PCSK9分泌的上調。

單克隆抗體治療誘導血管中PCSK9積聚作為免疫復合物的一部分，這一事實在評估PCSK9抑制劑的耐藥性時，可用作第一步診斷標志物，確認升高的血漿PCSK9將意味著抗體已經達到抗性作用，而正常水平的PCSK9將表明患者依從性、注射技術問題或者存在對循環中抗體的自由分布的皮膚病學、淋巴系統或系統性障礙的問題[19]。最后，因為近50%的PCSK9存在于LDL顆粒上，所以假定通過注射單克隆抗體產生的大部分免疫復合物將與LDL結合是合理的。這是否與干預的生化或臨床功效相關尚不清楚，但可以作為研究工具來識別攜帶PCSK9的LDL亞群。

2.PCSK9抑制劑的安全性:到目前為止，所有2期和3期研究都強烈提示alirocumab和evolocumab的安全性極佳，包括達到LDL-C水平<15mg/dl的試驗參與者。最常見的治療后出現的不良反應為局部注射反應，其他少見的包括類固醇激素和維生素水平的變化，還有神經認知障礙以及感染和癌癥的風險[20]。目前使用PCSK9抑制劑的安全性數據在開放標簽延伸試驗中延長至52～78周[21]。在FOURIER的開放標簽延伸試驗中將繼續監測極低LDL-C水平的長期安全性。

3.PCSK9抑制劑和他汀類藥物:根據臨床試驗證據，對于正在服用他汀類藥物和(或)依澤替米貝在內的最大耐受性口服治療，LDL-C水平仍達70mg/dl的高風險患者，推薦使用PCSK9抑制劑降低LDL-C。眾所周知，服用他汀類藥物的患者中有5%～20%會出現他汀類藥物相關的肌肉癥狀[22]，這可能導致他汀類藥物強度不理想。PCSK9抑制劑和他汀類藥物有一些相似之處和一些重要差異。在最高劑量下，他汀類和PCSK9抑制劑均使血漿LDL-C水平降低約60%。他汀類藥物傾向于比PCSK9抑制劑更能降低血漿甘油三酯水平(25%～35%∶15%)[20]。不過，在降低血漿脂蛋白B的水平上，這兩者沒有差異。但是，PCSK9抑制劑使血漿脂蛋白A的水平降低約25%，而他汀類藥物不會降低，甚至可能增加血漿脂蛋白A水平。相比之下，他汀類藥物似乎具有抗炎作用，例如他汀類藥物治療后血漿中C反應蛋白水平可降低，而PCSK9抑制劑對通過高敏感度檢測測得的C反應蛋白水平沒有影響[23]。除了LDL-C水平之外，PCSK9抑制劑和他汀類藥物對其他參數的不同作用是否會轉化為臨床風險降低的差異，仍然是一個尚未解決的問題。

4.PCSK9抑制劑可顯著降低ASCVD事件風險:許多前瞻性隊列研究、自然隨機化研究和隨機臨床試驗證實血管絕對暴露于低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)與心血管事件的風險之間存在對數線性關聯[23]。臨床試驗已證明，PCSK9抑制劑可以使心血管事件減少，特別是對于近期急性冠狀動脈綜合征、多支冠狀動脈疾病或外周動脈疾病的患者。降低LDL-C可能沒有下限，當LDL-C顯著降低至<20mg/dl的水平時，常伴隨著甚至更低的動脈粥樣硬化心血管疾病事件發生率[24]。用完全人PCSK9單克隆抗體降低頑固性高LDL-C，可能有更有利的安全性特征。

大量的動脈壁成像研究已經證明了降脂藥可以減輕動脈粥樣硬化斑塊的負荷和延緩其進展。有證據表明，當LDL-C水平低于70mg/dl時，動脈粥樣硬化斑塊會出現倒退。GLAGOV研究評估了evolocumab對斑塊成分的影響。與繼續他汀類單一療法組比較，用evolocumab和他汀類藥物療法組合治療的患者中可以觀察到斑塊鈣化的增加[25]。這表明，強化脂質降低會導致斑塊消退和鈣化，這可能會穩定斑塊并減少心血管事件。

四、臨床心血管試驗

迄今為止，3項隨機、雙盲、安慰劑對照的心血管預后試驗評估了PCSK9抑制劑的療效。

1.FOURIER試驗：evolocumab的FOURIER試驗是PCSK9抑制劑首次成功完成的心血管試驗[20]。共有27564例患有臨床明顯ASCVD的患者，特別是具有心肌梗死(myocardial infarction，MI)、非出血性卒中或癥狀性外周動脈疾病病史的患者，參加了該試驗。在試驗過程中，與安慰劑比較，evolocumab治療顯著降低了主要終點風險的15%(HR=0.85,95%CI：0.79～0.92)和主次要終點降低20%(HR=0.80,95%CI：0.73～0.88)。致死性或非致死性MI、致死性或非致死性腦卒中和冠狀動脈血運重建的風險顯著降低(21%～27%)。evolocumab的臨床益處在人口統計學亞組中基本一致。重要的是，基線LDL-C水平亞組的益處也是一致的，包括基線LDL-C水平<70mg/dl的患者，其中與安慰劑比較，evolocumab將LDL-C降低至21mg/dl并對于心血管風險、死亡、MI或腦卒中等風險降低30%(HR=0.70,95%CI：0.48～1.01)。

2.SPIRE-1和SPIRE-2試驗：對于bococizumab的SPIRE-1和SPIRE-2試驗的結果與FOURIER試驗的結果是同時提出的。在認識到由于中和抗體的開發，人源化但非完全人單克隆抗體bococizumab對血漿LDL-C水平降低的影響不能持續時，申辦者提前終止了這些試驗。

3.ODYSSEY結果試驗：鑒于結果尚未公布，2018年3月美國ACC科學會議上提出的ODYSSEY結果試驗的結果應視為初步結果。在住院治療MI或不穩定型心絞痛后1～12個月，共有18924例患者參加了ODYSSEY試驗。在試驗過程中，與安慰劑比較，alirocumab顯著降低了主要終點的風險15%(HR=0.85,95%CI：0.78～0.93，P=0.003)。alirocumab對復合終點的各個組成部分(包括冠心病死亡)的影響是方向一致的。值得注意的是，在ODYSSEY結果試驗中，ACS與隨機化之間的時間間隔要短于FOURIER試驗。但有證據表明，ACS患者在前面的降脂試驗中發現的事件曲線的早期差異可能與降低C反應蛋白水平相關，其影響可能比LDL-C水平降低更大。PCSK9抑制劑可有效降低LDL-C水平，但對C反應蛋白水平沒有影響。

盡管近年來取得了重大進展，但PCSK9抑制劑作為降低ASCVD風險的策略仍處于起步階段。目前，PCSK9抑制劑用于ASCVD一級預防的用途僅限于那些患有FH的患者。尚未確定早期和侵襲性LDL-C降低與已證實的療法(PCSK9抑制劑)是否可以預防年輕、有風險的患者的動脈粥樣硬化。除了目前可用的單克隆抗體外，還開發了每年1次的疫苗和每年2次的皮下注射，這兩種方法都更方便。 Inclisiran是一種靶向PCSK9 mRNA的小干擾RNA，導致肝臟中PCSK9合成減少，似乎接下來有希望降低LDL-C的新熱點。在第1天和第90天給予300mg劑量后，然后每6個月注射1次，inclisiran可以將LDL-C水平降低至53%。LDL-C的這種減少類似于每2～4周施用的alirocumab和evolocumab所實現的減少。鑒于其與單克隆抗體比較具有根本不同的作用機制，使用該藥劑計劃的更大規模的ASCVD結果，隨機臨床試驗是必不可少的。

五、展 望

綜上所述，PCSK9時代的心血管風險預防領域已經開始到來。即將發生的影響可能是在某些臨床實踐指南中重新引入LDL-C效力監測，并建議甚至更普遍的更嚴格的目標LDL-C水平。PCSK9抑制劑現已被證明是臨床醫生用于治療血脂異常的有效補充。通過使血漿LDL-C水平降低約60%，顯著降低主要血管事件的風險，除注射部位反應外幾乎無其他不良反應。具有高ASCVD負擔的患者發生主要血管事件的風險會增加，這類人群會受益于PCSK9抑制的相對和(或)絕對風險降低。在PCSK9抑制試驗中觀察到的臨床益處發生在將血漿LDL-C降低至約20mg/dl的水平，表明應采用更具侵襲性的LDL-C靶標。如果PCSK9 siRNA抑制劑的臨床療效和安全性得到驗證，這些療法可以提供更早和更容易干預治療血脂異常的機會，并可能在很大程度上根除冠心病。